《Journal of Biological Chemistry》：Age-dependent induction of ER stress in retinal pigment epithelium impairs phagocytosis via ADAM17-dependent MERTK shedding
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本研究探讨了年龄相关性黄斑变性（AMD）中视网膜色素上皮（RPE）吞噬功能下降的机制。研究人员聚焦于内质网（ER）应激如何通过Ca2+依赖性的ADAM17成熟，导致关键吞噬受体MERTK的脱落，进而损害RPE对感光细胞外节（POS）的清除能力。该发现揭示了ER应激是年龄相关RPE功能障碍的关键驱动因素，为靶向ER-ADAM17-MERTK通路治疗AMD提供了新思路。
我们的视觉之所以清晰，离不开眼底一层特殊的细胞——视网膜色素上皮（RPE）细胞的辛勤工作。它们就像眼睛里的“清洁工”，每天都要吞噬和消化感光细胞脱落下来的废弃片段，即感光细胞外节（POS）。这个过程对维持视网膜健康和正常视觉功能至关重要。然而，随着年龄增长，这位“清洁工”的效率会逐渐下降。这种功能衰退被认为是年龄相关性黄斑变性（AMD）等致盲性眼病发生的关键因素。但一个根本问题始终悬而未决：究竟是什么机制导致了RPE细胞吞噬功能的“衰老”？以往的研究提示，细胞内一种名为内质网（ER）的“蛋白质加工厂”在压力下会功能紊乱，即发生内质网应激（ER stress），这可能与多种年龄相关疾病有关。在AMD患者的RPE细胞中也观察到了内质网形态异常。那么，年龄增长是否真的会首先“攻击”RPE细胞的内质网？内质网应激又是否会直接“切断”RPE细胞的“清洁”能力？其背后的分子开关是什么？由Hiroto Yasuda、Shinsuke Nakamura等人组成的研究团队在《Journal of Biological Chemistry》上发表的研究，正是为了揭开这层层谜团。
研究人员综合运用了多项关键技术来探索上述问题。在动物模型上，他们比较了年轻（2月龄）与中年（12月龄）小鼠视网膜与RPE-脉络膜复合体中内质网应激标志物的表达差异。在细胞模型上，他们主要使用了人源RPE细胞系（ARPE-19）和原代人视网膜色素上皮细胞（hRPE），并通过药物（衣霉素Tm，毒胡萝卜素Tg）诱导内质网应激。核心功能评估包括：使用荧光标记（FITC或pHrodo）的POS进行体外吞噬功能测定，以量化RPE细胞对POS的摄取和降解能力；利用LysoTracker染色和线粒体压力测试（Seahorse分析仪）分别评估溶酶体活性和线粒体功能。在机制探索层面，他们通过蛋白质免疫印迹（Western blot）分析了内质网应激标志物、吞噬相关信号蛋白（如MERTK, p-FAK）及ADAM17的表达与活化；通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和细胞培养上清蛋白质印迹检测了MERTK胞外域的脱落；利用siRNA敲低ADAM17以及质粒过表达分子伴侣（ATF6n, XBP1s）来验证特定分子的功能；并通过免疫荧光染色观察了ADAM17在细胞内的定位。
Expression of ER stress marker proteins in retina and RPE-choroid complex in 2- and 12-month-old mice
研究人员首先在动物体内寻找年龄与内质网应激关联的证据。他们发现，在12月龄中年小鼠的RPE-脉络膜复合体中，多种内质网应激标志蛋白（如ATF6n、XBP1s、p-eIF2α、ATF4、GRP78、GRP94、CHOP）均显著上调。然而，在相同年龄小鼠的神经视网膜中，这些蛋白的表达大多没有变化或仅轻微增加。这一结果表明，在衰老过程中，内质网应激可能优先在RPE组织中发生，这或许解释了RPE为何对衰老相关损伤尤为敏感。
The induction of ER stress attenuated POS phagocytosis in cultured RPE cells
接下来，研究在细胞水平证实了内质网应激对吞噬功能的直接损害。使用衣霉素（Tm）或毒胡萝卜素（Tg）诱导内质网应激后，无论是ARPE-19细胞还是原代hRPE细胞，其对荧光标记POS的吞噬和降解能力均显著下降。这种损害在短时间（6小时）高浓度或长时间（54小时）低浓度Tm处理下均会出现，且并非由细胞死亡引起，表明是内质网应激本身导致了功能缺陷。
Tm attenuated lysosomal and mitochondrial activity in RPE cells.
吞噬的物质最终需要在溶酶体内被降解。研究发现，Tm诱导的内质网应激还会导致细胞器功能紊乱。处理6小时后，RPE细胞内的溶酶体活性（通过LysoTracker荧光强度评估）显著降低。更早地，在处理3小时后，线粒体的基础呼吸和最大呼吸能力就已经下降。这表明内质网应激可能通过损害线粒体能量供应，进而影响依赖ATP的溶酶体酸化功能，最终阻碍吞噬物质的彻底降解。
Effectiveness of ER stress inhibition on phagocytic dysfunction.
那么，缓解内质网应激能否逆转这种功能障碍呢？答案是肯定的。使用化学分子伴侣4-苯基丁酸钠（4-PBA）处理，可以剂量依赖性地减轻Tm引起的吞噬功能下降和溶酶体功能障碍。此外，通过质粒转染过表达内质网应激应答中的关键转录因子ATF6n或XBP1s，从而上调GRP78、GRP94等保护性分子伴侣蛋白，同样能够缓解Tm诱导的吞噬功能损伤。这证明靶向抑制内质网应激是改善RPE吞噬功能的有效策略。
ER stress induction attenuated phagocytosis-related signaling.
研究进一步深入到信号分子层面。POS的识别和卷入依赖于细胞表面的Mer酪氨酸激酶受体（MERTK）及其下游信号。研究人员发现，Tm处理不仅降低了MERTK的总蛋白水平，更关键的是，其胞外结构域在细胞培养上清中的含量显著增加，而细胞内的磷酸化MERTK（p-MERTK）和磷酸化黏着斑激酶（p-FAK）水平则下降。这意味着内质网应激导致MERTK被“切割”并从细胞膜上脱落，从而丧失了启动吞噬信号的能力。
Tm induced MERTK shedding via Ca2+-dependent ADAM17 maturation.
是谁“剪断”了MERTK？机制研究指向了去整合素-金属蛋白酶17（ADAM17）。Tm诱导内质网应激后，ADAM17的成熟形式（matADAM17）随时间增加而增多。这种成熟过程依赖于弗林蛋白酶（Furin）的剪切，而Furin的活性又受钙离子（Ca2+）调控。研究发现，内质网应激导致内质网内的Ca2+通过IP3受体释放，激活Furin，进而促进ADAM17成熟。成熟的ADAM17则负责切割MERTK的胞外域。当使用siRNA敲低ADAM17后，Tm引起的MERTK减少和POS摄取障碍均得到显著缓解。2+ release from inositol-1,4,5-trisphosphate receptors contributes to MERTK shedding and dysfunction of POS uptake.">
Expression of ADAM17 in aged murine RPE-choroid.
最后，研究回到动物模型，验证这一机制在生理衰老中的相关性。在12月龄小鼠的RPE-脉络膜组织中，ADAM17的前体形式（preADAM17）和成熟形式（matADAM17）的表达量均比年轻小鼠显著升高。这提示，年龄增长本身就能上调RPE中ADAM17的表达，为年龄相关的MERTK脱落和吞噬功能下降提供了体内证据。
研究结论与意义
这项研究系统地阐明了年龄相关性RPE吞噬功能下降的一个全新整合机制。研究结论可归纳为：首先，在衰老过程中，RPE-脉络膜组织比其他视网膜组织更早地出现内质网应激。其次，内质网应激会直接损害RPE细胞对POS的吞噬和降解能力，并伴随溶酶体和线粒体功能障碍。第三，在机制上，内质网应激通过诱导Ca2+从内质网释放，激活Furin蛋白酶，促进ADAM17成熟；成熟的ADAM17进而切割并脱落RPE细胞膜上关键的吞噬受体MERTK，同时下调FAK磷酸化，从而“双管齐下”地阻断吞噬信号的启动。最后，在衰老小鼠的RPE组织中同样观察到ADAM17的上调，证实了该通路在生理衰老中的潜在作用。
该研究的重要意义在于：从科学认知层面，它首次将年龄、内质网应激、ADAM17成熟、MERTK脱落和RPE吞噬功能障碍串联成一个清晰的因果链条，为理解AMD等年龄相关性视网膜疾病的早期发病机制提供了关键分子图景。从转化医学层面，研究揭示了多个潜在的治疗靶点。无论是使用4-PBA等化学分子伴侣缓解内质网应激，还是通过基因手段增强细胞自身的分子伴侣防御体系（如ATF6/XBP1通路），亦或是直接抑制ADAM17的活性，都可能成为延缓RPE衰老、预防或治疗AMD的新策略。这项研究不仅增进了我们对眼睛“清洁工”如何“变老”的理解，更为对抗随之而来的“视觉危机”点亮了新的希望之光。
