异常剪接体中间体的结构解析：揭示pre-mRNA剪接质量控制新机制

本研究针对pre-mRNA剪接过程中异常剪接体的识别与解聚机制这一关键科学问题，通过冷冻电镜技术解析了裂殖酵母中两个处于解聚途中的post-Bact剪接体中间体（spBd-I和spBd-II）的高分辨率结构。研究发现DEAH-box解旋酶Gih35（同源人类DHX35）与其G-patch蛋白伴侣Gpl1通过重塑活性中心维持催化休眠状态，并揭示了5'剪接位点单核苷酸插入导致剪接体走向解聚的分子机制。该成果为理解真核生物pre-mRNA剪接质量控制提供了重要结构基础，对遗传病相关剪接异常的研究具有重要启示意义。

　　

在真核生物基因表达过程中，pre-mRNA剪接是一个高度精确的调控环节，其异常会导致约30%的人类遗传疾病。虽然经典剪接体循环的关键步骤已被阐明，但对于错误剪接中间体如何被识别并导向降解途径的结构机制仍属空白。这一科学问题的解答，对理解细胞质量控制机制和开发相关疾病治疗策略具有重要意义。

德国海德堡大学欧洲分子生物学实验室（EMBL）的研究团队在《Nature Structural & Molecular Biology》发表重要成果，通过冷冻电镜技术首次解析了裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中两个处于解聚途中的异常剪接体中间体（spB^d-I和spB^d-II）结构，平均分辨率分别达到3.2?和3.1?。研究创新性地采用split-tag纯化策略，结合冷冻电镜三维重构、交联质谱和RNA测序等技术，揭示了DEAH-box解旋酶Gih35-Gpl1异源二聚体在异常剪接体识别中的核心作用。

关键技术方法包括：（1）裂殖酵母双标签（Myc-TEV-Protein A与6Flag）亲和纯化系统获取天然剪接体复合物；（2）300kV冷冻电镜采集13,096张显微图像；（3）RELION 3.1和cryoSPARC V3.1进行三维重构；（4）交联质谱鉴定蛋白相互作用网络；（5）RNA免疫沉淀测序分析底物特异性。

主要研究结果

异常剪接体中间体的捕获与鉴定

通过Nrl1-Prq43双标签纯化策略，研究人员成功捕获了与剪接体解聚因子Ntr1复合物共纯化的post-B^act剪接体。质谱分析鉴定出包括U5 snRNP、NTC核心复合物等32个蛋白组分，其中DEAH-box解旋酶Gih35及其G-patch蛋白伴侣Gpl1的稳定存在提示其在异常剪接体识别中的特殊作用。

剪接体核心的结构重塑

高分辨率结构显示spB^d复合物呈现独特的"B-ILS混合"构象：既保留B状态的Cwf11（人类Aquarius同源物）等催化激活因子，又具有ILS状态的Ntr1 CTD结合特征。引人注目的是，U2 snRNP核心结构域完全缺失，而5'外显子稳定因子Cwc21/Cwc22异常滞留，这些特征共同标志着这是一个偏离正常剪接途径的中间体。

Gih35-Gpl1的分子刹车机制

结构分析首次揭示Gpl1通过多结构域锚定策略将Gih35招募至剪接体：其N端（38-69aa）深入活性中心与pre-mRNA相互作用；"分子铰链"（123-137aa）插入Prp8 RNase H结构域（Prp8^RH）使其保持极端开放构象；C端（199-234aa）占据Prp8的中央空腔。这种独特的结合方式不仅稳定了异常剪接体构象，还通过Gpl1 Phe60与5'剪接位点G₊₁的碱基堆积作用，直接阻碍了分支螺旋（branch helix）的正确对接。

5'剪接位点的异常构象

RNA密度图显示spB^d复合物中存在非经典的5'剪接位点构型：U5 loop I与5'外显子A_-2A_-3A_-4A_-5形成类密码子-反密码子的紧密双链，迫使5'剪接位点处产生单核苷酸插入（0位）。对裂殖酵母ctr1△突变体的RNA-seq分析证实，这种外显子四腺苷酸 motif在CNM复合物敏感型转录本中显著富集，其中核糖体蛋白基因rpl39是最主要的天然底物。

Ntr1复合物的阶梯式组装

比较spB^d-I和II状态发现，Ntr1超螺旋结构域的稳定需要Bis1（人类ESS2同源物）和Saf4（酵母Yju2同源物）的协同作用。这种构象依赖性招募机制解释了Prp43如何被精准定位到异常剪接体上，为理解剪接质量控制的特异性提供了结构基础。

研究结论与意义

该研究首次在原子水平揭示了异常剪接体走向解聚的结构途径，提出了"Gih35-Gpl1分子刹车"的质量控制新机制：当5'剪接位点因U5-U6 RNA异常配对产生构象畸变时，Gpl1通过多位点结合将构象变化传递至剪接体表面，招募Ntr1复合物启动Prp43介导的解聚程序。这一发现不仅完善了pre-mRNA剪接质量控制的理论框架，还为治疗剪接异常相关疾病（如脊髓性肌萎缩症等）提供了新的靶点思路。特别值得注意的是，Gih35（DHX35）在人类多种癌症中异常表达，其精确调控机制的解析可能为肿瘤治疗开辟新途径。

研究展现的结构生物学方法学创新——尤其是对瞬时存在的异常剪接体中间体的捕获策略，为今后研究其他RNA-蛋白质复合物的质量控制机制提供了范本。正如审稿人所评，这项工作"将剪接体研究从正常途径拓展到了异常调控领域，是该领域的重要突破"。