靶向ABCC4-cAMP-Epac2/Rap1a信号通路：通过抑制PCSK9表达增强LDLR清除能力的新机制

本研究通过全基因组CRISPR筛选，发现肝细胞膜转运蛋白ABCC4是LDLR的负向调控因子。机制上，抑制ABCC4可阻断cAMP外排，激活下游Epac2/Rap1a信号通路，从而在转录后水平抑制PCSK9蛋白表达，减少LDLR的溶酶体降解，最终促进LDL-C清除。该研究揭示了ABCC4-cAMP-PCSK9轴在脂质代谢中的新作用，为高胆固醇血症和动脉粥样硬化提供了新的治疗靶点。

　　

在心血管疾病领域，低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的异常升高是导致动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）的主要危险因素。肝细胞表面的低密度脂蛋白受体（LDLR）是清除循环中LDL-C的关键“清道夫”，其表达水平直接决定了血液中“坏胆固醇”的浓度。目前，他汀类药物和PCSK9抑制剂是临床上降低LDL-C的常用手段，但寻找新的、更有效的调控LDLR表达的靶点，对于开发新型降脂药物、满足不同患者的治疗需求具有重要意义。

为了系统性地寻找调控LDLR表达的新基因，上海交通大学医学院附属第六人民医院、四川省人民医院等机构的研究团队在《Communications Biology》上发表了一项最新研究。他们利用全基因组CRISPR/Cas9筛选技术，在AML12肝细胞中进行了大规模的功能性筛选，最终将目光锁定在了一个名为ABCC4的膜转运蛋白上。研究发现，抑制ABCC4能够显著增加肝细胞膜表面的LDLR数量，并有效降低血浆LDL-C水平，为高胆固醇血症的治疗提供了全新的思路。

关键技术方法

本研究主要采用了以下关键技术方法：

1. 1.
   全基因组CRISPR/Cas9筛选：利用流式细胞术（FACS）分选LDLR高表达细胞群，结合MAGeCK算法分析，系统性鉴定调控LDLR表达的基因。
2. 2.
   基因编辑与功能验证：在AML12和LO2细胞系中，利用CRISPR/Cas9技术敲除ABCC4、Epac2和Rap1a基因，验证其对LDLR表达和LDL摄取的影响。
3. 3.
   动物模型构建：通过尾静脉注射携带Abcc4 RNAi的AAV8病毒构建肝脏特异性敲低小鼠模型，以及通过腹腔注射ABCC4特异性抑制剂Ceefourin-1构建药物干预模型。
4. 4.
   分子机制探究：利用RNA测序（RNA-seq）、ELISA、免疫印迹（Western blot）等技术，深入解析ABCC4通过cAMP-Epac2/Rap1a信号通路调控PCSK9表达的分子机制。

研究结果

CRISPR筛选鉴定ABCC4为肝LDL受体的负向调控因子

为了寻找新的LDLR调控因子，研究人员在AML12肝细胞中进行了基于流式细胞术的全基因组CRISPR筛选。他们通过分选LDLR高表达（LDLR^high）的细胞亚群，并分析其中富集的sgRNA，最终鉴定出68个候选基因。其中，ATP结合盒转运蛋白C亚家族成员4（ABCC4）在两个独立的筛选重复中均被鉴定为排名最高的LDLR负向调控因子。ABCC4是一种位于肝细胞基底外侧膜的转运蛋白，负责将cAMP等底物泵出细胞。这一发现提示，ABCC4可能通过影响细胞内信号传导来调控LDLR的表达。

ABCC4缺失在不影响其基因表达的情况下增加细胞表面LDLR水平

为了验证筛选结果，研究人员在AML12和LO2细胞中分别敲除了Abcc4/ABCC4基因。结果显示，ABCC4的缺失显著增加了细胞膜表面的LDLR蛋白水平，但并未改变LDLR的mRNA表达量，表明其调控作用发生在转录后水平。进一步的Dil-LDL摄取实验证实，ABCC4敲除的细胞对LDL的摄取能力显著增强。此外，ABCC4的缺失并未影响细胞内胆固醇含量，也未改变SREBP2（胆固醇调节元件结合蛋白2）和HMGCR（3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶）等胆固醇合成相关基因的表达，提示其调控LDLR的机制独立于经典的胆固醇感应通路。

肝脏特异性破坏ABCC4促进肝细胞膜LDLR蛋白表达并降低血浆LDL胆固醇水平

为了在体内验证ABCC4的功能，研究人员通过尾静脉注射携带Abcc4 RNAi的AAV8病毒，构建了肝脏特异性敲低ABCC4的小鼠模型。结果显示，与对照组相比，肝脏特异性敲低ABCC4的小鼠，其肝脏膜上的LDLR蛋白表达显著增加，同时血浆LDL-C水平显著降低，而总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平无明显变化。这一结果在动物体内证实了ABCC4在调控LDLR表达和血浆LDL-C水平中的关键作用。

Ceefourin-1药物抑制ABCC4通过增强肝细胞表面LDLR蛋白表达促进血浆LDL胆固醇清除

为了探索ABCC4作为药物靶点的潜力，研究人员使用了ABCC4的特异性抑制剂Ceefourin-1。体外实验表明，Ceefourin-1处理能够显著增加AML12细胞膜表面的LDLR水平。在动物实验中，无论是正常饮食（NCD）还是高脂饮食（HFD）喂养的小鼠，腹腔注射Ceefourin-1均能显著降低血浆LDL-C水平，并增加肝脏膜上的LDLR蛋白表达。此外，Ceefourin-1处理还显著改善了HFD喂养小鼠的肝脏脂质沉积和胰岛素抵抗，显示出其在改善代谢紊乱方面的潜在益处。

ABCC4改变cAMP的细胞内分布从而阻断肝脏PCSK9表达

为了阐明ABCC4调控LDLR的分子机制，研究人员进行了转录组测序分析。结果显示，ABCC4的缺失导致细胞内cAMP水平升高，并激活了cAMP信号通路及其下游的Epac2/Rap1a信号通路。进一步研究发现，ABCC4的缺失或Ceefourin-1的抑制，均能显著降低细胞内和分泌到细胞外的PCSK9蛋白水平，但并未改变Pcsk9的mRNA表达。这一结果表明，ABCC4通过转录后机制调控PCSK9的蛋白水平。PCSK9是已知的促进LDLR溶酶体降解的关键蛋白，因此，ABCC4的缺失通过降低PCSK9水平，从而减少了LDLR的降解，使其更多地保留在细胞膜上发挥功能。

ABCC4-cAMP信号调控细胞表面LDLR可用性依赖于Epac2/Rap1a的关键作用

为了进一步确认下游信号通路，研究人员构建了Abcc4/Epac2双敲除（DKO）和Abcc4/Rap1a DKO的AML12细胞。结果显示，在同时敲除Epac2或Rap1a后，ABCC4缺失所导致的LDLR膜表达增加和LDL摄取增强的效应被完全逆转。同时，PCSK9蛋白水平也恢复到正常水平。这些结果证明，ABCC4-cAMP信号通路调控LDLR表达和LDL-C清除的作用，完全依赖于其下游的Epac2和Rap1a信号分子。

研究结论与讨论

本研究通过全基因组CRISPR筛选，首次将ABCC4鉴定为肝细胞LDLR的一个关键负向调控因子。研究揭示了ABCC4通过调控细胞内cAMP分布，激活Epac2/Rap1a信号通路，从而在转录后水平抑制PCSK9蛋白表达，最终增加LDLR膜表达并促进LDL-C清除的全新分子机制。这一发现不仅深化了我们对LDLR调控网络的理解，更重要的是，为开发治疗高胆固醇血症和动脉粥样硬化的新药提供了极具潜力的靶点。靶向ABCC4，有望成为继他汀类药物和PCSK9抑制剂之后，又一类有效的降脂治疗策略。