蛋白质毒性应激反应驱动T细胞耗竭与免疫逃逸的新机制

本研究针对T细胞耗竭这一肿瘤免疫治疗的关键瓶颈，通过多组学分析首次揭示了耗竭T细胞中存在独特的蛋白质毒性应激反应（Tex-PSR）。该研究证实Tex-PSR以全球蛋白质合成增加、蛋白质聚集体积累和特异性分子伴侣上调为特征，并发现持续AKT信号通路是其主要驱动因素。更重要的是，研究团队通过基因编辑技术证明靶向Tex-PSR相关分子伴侣可显著改善癌症免疫治疗效果，为克服肿瘤免疫耐受提供了新的治疗策略。

　　

在慢性感染和肿瘤微环境中，T细胞往往会进入一种功能失调状态，这种现象被称为T细胞耗竭。耗竭的T细胞不仅失去了清除病原体和肿瘤细胞的能力，还会高表达PD-1、TIM-3等抑制性受体，成为当前免疫治疗面临的主要挑战。尽管转录组学研究为理解T细胞耗竭提供了重要线索，但越来越多的证据表明mRNA水平并不能完全反映蛋白质的实际表达情况，这提示我们需要从蛋白质层面更深入地探索T细胞耗竭的分子机制。

在这项发表于《自然》杂志的最新研究中，研究人员通过整合多组学分析技术，系统性地揭示了T细胞耗竭过程中一个此前未被充分认识的生物学过程——蛋白质毒性应激反应。该研究团队发现，耗竭T细胞中存在着一种独特的应激反应模式，与传统应激反应减少蛋白质合成的模式截然不同，这种被命名为Tex-PSR的反应竟然伴随着全球蛋白质合成速率的增加。

为了全面解析T细胞耗竭的分子特征，研究团队运用了多种关键技术方法：首先建立了体外T细胞耗竭模型并通过平行RNA测序和定量质谱蛋白质组学进行分析；利用淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）急慢性感染模型以及MC38结肠癌和MB49膀胱癌小鼠模型获取不同状态的T细胞；采用色谱图库方法提高蛋白质组学数据的检测灵敏度和重现性；通过CRISPR-Cas9基因编辑技术验证关键分子的功能；使用单细胞RNA测序数据分析人类癌症样本中的Tex-PSR特征。

Discordance between RNA and protein levels

研究人员首先通过体外T细胞耗竭模型，对比分析了T_eff细胞和T_ex细胞中mRNA与蛋白质表达水平的相关性。结果显示，两者之间存在显著的不一致性，Pearson相关系数仅为0.31-0.38。特别值得注意的是，代谢途径相关蛋白的表达变化在mRNA水平上未能得到充分体现，这强调了直接进行蛋白质组学分析的必要性。

PSR and specialized chaperone enrichment

通过动力学蛋白质组学分析，研究人员发现T_ex细胞中内质网应激反应相关蛋白显著上调，同时伴随着蛋白质转运、修饰和质量控制相关分子的表达增加。特别值得注意的是，一组特异性分子伴侣如gp96（GRP94）和BiP在T_ex细胞中呈现选择性高表达，而在T_eff细胞中则无明显变化。

Dysregulated proteostasis in Tex cells

研究团队通过NIAD-4和CRANAD-2荧光染色技术，直接观察到T_ex细胞中蛋白质聚集体的显著积累。令人意外的是，尽管存在明显的蛋白质稳态失衡，T_ex细胞的全球蛋白质合成速率反而升高，这与传统的应激反应模式截然不同。通过OPP（O-propargyl-puromycin）标记实验，研究人员证实终末耗竭T细胞（T_tex）的蛋白质合成活性最高。

Molecular definition of protein aggregates

为了明确T_ex细胞中易聚集蛋白的组成，研究团队采用天然凝胶电泳结合质谱分析技术，发现74%的检测蛋白在耗竭状态下从低分子量物种向高分子量物种迁移，表明蛋白质聚集是全局性现象。其中，颗粒酶B、穿孔素等效应分子以及Tex-PSR分子伴侣gp96和BiP都表现出明显的聚集倾向。

Misfolded proteins drive exhaustion

为验证蛋白质聚集是T细胞耗竭的原因而非结果，研究人员通过两种方法诱导蛋白质错误折叠：使用L-腈氨酸类似物AZC处理，以及在T细胞中表达易聚集的CFTR（ΔF508）突变体。结果显示，即使在非耗竭条件下，蛋白质错误折叠也足以诱导T细胞出现典型的耗竭表型，这确立了蛋白质稳态失调在T细胞耗竭中的因果关系。

Sustained AKT activity causes exhaustion

通过蛋白质组学分析，研究人员发现AKT信号通路在终末耗竭T细胞中特异性上调。使用低剂量AKT抑制剂MK2206处理可显著改善T细胞功能，而mTOR或PI3K抑制剂则无此效果。更重要的是，表达持续激活的myrAKT足以在非耗竭条件下诱导T细胞出现Tex-PSR特征和耗竭表型。

Tex-PSR chaperones underlie exhaustion

通过CRISPR-Cas9筛选，研究人员发现敲除Hspa5、Hsp90b1和Ero1a等Tex-PSR相关分子伴侣基因可显著增强细胞因子产生，改善T细胞功能。在体内实验中，CD8⁺T细胞特异性敲除Hsp90b1的小鼠在慢性LCMV感染模型中表现出更好的病毒特异性T细胞应答。类似地，在肿瘤模型中，分子伴侣缺陷的T细胞显示出更强的抗肿瘤能力。

Clinical relevance of Tex-PSR in cancer

最后，研究人员分析了人类癌症单细胞转录组数据，发现Tex-PSR特征在终末耗竭T细胞中最为显著，且高Tex-PSR评分与肝癌患者的不良预后相关。更重要的是，在接受抗PD-1治疗或CAR-T治疗的患者中，无应答者的T细胞表现出更高的Tex-PSR特征，这提示Tex-PSR可能成为预测免疫治疗响应的生物标志物。

这项研究系统性地揭示了蛋白质毒性应激反应在T细胞耗竭中的核心作用，提出了Tex-PSR作为T细胞耗竭的新标志和机制驱动因素。研究不仅阐明了持续AKT信号通过破坏蛋白质稳态促进T细胞耗竭的分子通路，还验证了靶向Tex-PSR相关分子伴侣改善免疫治疗效果的可行性。这些发现为理解T细胞功能失调提供了全新视角，为开发针对蛋白质稳态通路的新型癌症免疫治疗方法奠定了理论基础。特别值得注意的是，该研究强调了在转录组学之外进行蛋白质组学分析的重要性，揭示了 mRNA与蛋白质表达之间的复杂关系，为未来免疫学研究提供了重要方法学参考。