基于CRISPR/Cas9技术在人iPSC来源巨噬细胞中发现TNFRSF1A基因内含子1具有增强子活性的证据

本研究针对TNFRSF1A基因调控机制不清的问题，利用CRISPR/Cas9技术在人诱导多能干细胞(iPSC)来源的巨噬细胞中开展功能基因组学研究，发现该基因第一内含子区域存在一个功能性增强子。通过多组学分析(ATAC-Seq、ChIP-Seq、RNA-Seq)证实该增强子缺失会导致TNFRSF1A表达显著下调，为解析自身免疫疾病GWAS变异的功能机制提供了重要实验依据。

　　

在自身免疫疾病治疗领域，肿瘤坏死因子α(TNFα)是一个重要的药物靶点，其促炎功能主要通过受体TNFRSF1A介导。尽管全基因组关联研究(GWAS)已发现TNFRSF1A基因座与多种免疫介导疾病相关，包括强直性脊柱炎、多发性硬化和炎症性肠病，但大多数疾病相关变异位于基因组的非编码区域，这给理解其功能后果带来了挑战。限制因素之一是对TNFRSF1A基因调控的理解不完整，特别是在与炎症和免疫相关的特定细胞环境（如巨噬细胞）中。

为了解开这一谜团，Julie A. Osgood等研究人员在《Scientific Reports》上发表了一项创新性研究，利用前沿的基因编辑技术探索TNFRSF1A基因座的调控机制。研究人员关注的是该基因内含子区域可能存在的调控元件，这些元件可能在基因表达调控中发挥关键作用，但此前缺乏直接的功能性证据。

研究团队首先通过生物信息学分析发现，在三种疾病相关细胞类型（CD14+单核细胞、CD4+和CD8+T细胞）中，TNFRSF1A基因的第一内含子区域存在开放染色质和增强子特征性组蛋白标记（H3K27ac、H3K4me1），提示该区域可能具有增强子功能。这一发现在ENCODE数据库和其他公共资源中得到了进一步验证，显示该区域在多种细胞类型中都具有开放染色质特征，且存在转录因子结合位点。

研究人员建立了一套完整的研究体系，关键方法包括：使用CRISPR/Cas9基因组编辑技术在人类诱导多能干细胞(iPSC)中特异性删除候选增强子区域；将编辑后的iPSC分化为巨噬细胞（采用van Wilgenburg等人建立的protocol）；通过多种功能基因组学技术评估编辑后果，包括转座酶可及染色质测序(ATAC-Seq)分析染色质开放性，染色质免疫沉淀测序(ChIP-Seq)分析组蛋白修饰（H3K27ac），以及RNA测序(RNA-Seq)分析基因表达变化。所有iPSC系均来自牛津大学建立的SFC840-03-03细胞系（健康供者来源）。

Epigenomic landscape of TNFRSF1A indicates a putative regulatory element in intron 1

研究人员通过对原发性免疫细胞的表观基因组数据分析，发现TNFRSF1A基因启动子在所有测试细胞类型中都具有开放性且表现活跃。更重要的是，在第一内含子区域观察到的ATAC-Seq峰和组蛋白标记（H3K27ac、H3K4me1）与增强子的特征一致。荧光素酶报告基因实验进一步证实了这一发现，显示该内含子区域能够使最小启动子的活性提高约25倍。

iPSC-derived macrophage cell model generation

研究团队验证了iPSC来源的巨噬细胞作为研究TNFRSF1A基因调控的相关模型。通过比较iPSC分化巨噬细胞与原代CD14+单核细胞的多组学数据，发现两者在TNFRSF1A基因座的表现遗传景观高度相似。流式细胞术分析显示，分化后的细胞高表达巨噬细胞标志物CD11b和CD14，证实了成功分化。

Deletion of putative enhancer region using CRISPR/Cas9

研究人员使用CRISPR/Cas9基因组编辑技术删除了约3.3kb的候选增强子区域（chr12:6444399-6447744, hg19），获得了三个纯合删除的iPSC克隆。实验设计包括CRISPR对照组（转染但未编辑）和亲本对照组，所有细胞系均分化为巨噬细胞用于后续分析。

The targeted Intronic region has evidence of enhancer activity for TNFRSF1A

功能基因组学分析显示，删除内含子增强子区域导致该区域的染色质开放性显著降低（FDR为2.3×10^-4），同时H3K27ac信号也相应消失（FDR为1.24×10^-6）。全基因组分析未发现其他脱靶效应，表明编辑具有高度特异性。

RNA-Seq分析显示，删除内含子增强子区域导致TNFRSF1A基因表达显著下调（log2倍变化为-0.24，FDR为1.8×10^-7）。在同一拓扑关联结构域(TAD)内的其他基因表达未受影响，表明该增强子对TNFRSF1A具有特异性调控作用。

讨论与结论

这项研究通过多学科方法提供了TNFRSF1A基因第一内含子具有增强子活性的直接功能证据。研究结果与最近的发现相呼应，即转录因子ETV7和STAT3在该内含子区域结合并调控TNFRSF1A基因表达。此外，该区域内的单核苷酸多态性(SNP)已被鉴定为TNFRSF1A的单核细胞表达数量性状位点(eQTL)，并与多种免疫疾病相关。

该研究的创新之处在于建立了iPSC来源巨噬细胞与CRISPR/Cas9基因组编辑相结合的研究平台，证明这一工作流程可用于功能基因组学研究，并通过表观遗传读出技术（如ATAC-Seq和ChIP-Seq）有效监测脱靶效应。

研究的局限性包括观察到的基因表达效应幅度较小，以及在qPCR验证中未达到统计学显著性，这可能反映了后一检测方法的灵敏度限制。未来研究可通过增加重复样本、使用CRISPR干扰(CRISPRi)和CRISPR激活(CRISPRa)等更精确的调控工具，以及在TNFα刺激或其他免疫相关条件下评估该增强子的功能，进一步阐明其调控动力学和生理相关性。

这项研究不仅增进了对TNFRSF1A基因调控机制的理解，也为解析GWAS发现的非编码变异的功能意义提供了重要范例。理解这些变异所在的基因组背景，将使我们更接近解析复杂疾病病因学的目标，并有望发现有效的药物治疗靶点。