野生二粒小麦来源的成对NLR基因PmWR183协同调控小麦白粉病抗性研究

本研究报道了从小麦野生祖先种野生二粒小麦中图位克隆到一个白粉病抗性位点PmWR183，该位点编码两个相邻的NLR蛋白。通过稳定遗传转化和CRISPR/Cas9基因编辑实验证明，这两个NLR基因必须协同作用才能赋予小麦对白粉病的抗性。该抗性表现出发育阶段依赖性，在苗期感病而成株期表现出强抗性。蛋白质互作实验证实了PmWR183-NLR1和PmWR183-NLR2之间的组成型互作关系。研究为小麦抗病育种提供了宝贵的基因资源。

　　

小麦作为全球最重要的粮食作物之一，为人类提供了20%的能量和膳食蛋白质。然而，病虫害的爆发对小麦生产构成了严重威胁。由真菌病原体Blumeria graminis f. sp. tritici (Bgt)引起的白粉病是全球最具破坏性的小麦病害之一。利用抗病基因是减轻作物病害导致产量损失的最有效策略之一，但由于病原菌毒性的快速进化，遗传抗性常常被克服。因此，植物与病原体之间的持续军备竞赛需要不断鉴定和部署新的抗病基因来增强小麦的抗病性。

野生二粒小麦作为现代栽培四倍体和六倍体小麦的野生祖先，具有丰富的遗传变异，尤其是富含抗病基因资源。迄今为止，已有20多个白粉病抗性基因/等位基因在野生二粒小麦中被报道，但仅有少数被成功克隆。植物进化出了复杂的免疫系统来防御多种病原体，主要由细胞内核苷酸结合富亮氨酸重复序列(NLR)受体介导。这些NLR可以作为单基因、基因对或在复杂的信号网络中发挥作用。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，研究人员克隆了一个白粉病抗性位点PmWR183，该位点由一对源自野生二粒小麦的NLR蛋白控制。通过稳定遗传转化和CRISPR/Cas9介导的敲除实验表明，PmWR183-NLR1/PmWR183-NLR2对协同赋予普通小麦对白粉病的抗性。蛋白质互作实验证明，PmWR183-NLR1和PmWR183-NLR2参与同源和异源互作，表明它们在免疫信号通路中具有协同作用。

研究人员主要采用了图位克隆、PacBio SMRT长读长基因组测序、稳定遗传转化、CRISPR/Cas9基因编辑、蛋白质互作分析（包括免疫共沉淀和分裂荧光素酶互补实验）以及单倍型分析等技术方法。研究材料包括来自野生二粒小麦的渗入系WE35及其后代WR183，以及全球范围的 tetraploid 和 hexaploid 小麦种质资源。

PmWR183是六倍体小麦中对白粉病的发育阶段依赖性抗性

研究人员发现，从WE35与普通小麦系S2199杂交的F₅后代中获得的纯合系WR183，在两叶期对白粉病敏感，在三叶和四叶期表现出部分抗性，而在成株期无论在温室还是田间条件下都表现出高抗性。遗传分析表明，WR183中的成株期白粉病抗性是从抗性亲本WE35遗传而来的显性单基因控制，暂时命名为PmWR183。

PmWR183的精细定位

通过批量分离子RNA测序(BSR-Seq)将PmWR183定位在2BS染色体上。利用3904株F₂群体进行精细定位，最终将PmWR183定位在标记WGGBL578和WGGBL456界定的0.37 cM遗传区间内，对应Fielder参考基因组260.1 kb的基因组区域。该区域包含6个基因，但基因组结构比较发现WR183和Fielder之间存在显著的基因组结构变异。

WE35品系的长读长基因组测序

研究人员对携带Pm64和PmWR183的WE35品系进行了PacBio SMRT长读长测序，获得了N50为4.4 Mb的高质量基因组组装。鉴定出一个2.5 Mb的contig（ctg001568），涵盖了PmWR183的整个295.6 kb物理区间。该区域注释了7个基因，包括一个exocyst component of 70-kDa (Exo70)、一个S-locus lectin protein kinase family member (Slpk)、一个F-box基因、两个NBS-LRR蛋白(PmWR183-NLR1和PmWR183-NLR2)、一个hypothetical protein (HP)和一个U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein Prp31 (Prp31)。

PmWR183的功能验证

通过CRISPR/Cas9系统敲除PmWR183-NLR2和PmWR183-NLR1，发现敲除植株在成株期对Bgt菌株E20敏感，表明这两个基因对白粉病抗性都是必需的。单独在感病小麦品种Fielder中过表达PmWR183-NLR1或PmWR183-NLR2不能赋予抗性，而共表达这两个基因则能恢复对白粉病的抗性。互补实验进一步证实了这两个基因的协同作用。

PmWR183-NLR1和PmWR183-NLR2表现出自身和相互互作

在本氏烟中瞬时表达实验显示，PmWR183-NLR1单独触发轻微的过敏反应(HR)样细胞死亡，而PmWR183-NLR2不诱导任何可见反应。免疫共沉淀和分裂荧光素酶互补实验证明PmWR183-NLR1和PmWR183-NLR2之间存在同源和异源互作。

PmWR183-NLR1和PmWR183-NLR2在祖先物种中的起源分析

系统进化分析表明，PmWR183-NLR1 orthologs仅存在于Ae. bicornis和Ae. sharonensis中，而PmWR183-NLR2在任何已测序的Aegilops物种中都没有发现orthologs。研究人员推测PmWR183-NLR2可能起源于特定Aegilops物种中的复制事件，随后与含有PmWR183-NLR1基因的另一个Aegilops物种杂交和重组，形成了NLR基因对。

PmWR183-NLR1和PmWR183-NLR2的单倍型分析和地理分布

在57份携带PmWR183-NLR1和PmWR183-NLR2的小麦材料中，PmWR183-NLR1鉴定出5种单倍型，PmWR183-NLR2鉴定出7种单倍型。两种基因的不同组合被分为10种不同的单倍型。携带PmWR183等位基因的野生二粒小麦材料主要分布在以色列南部Levant群体中，硬粒小麦材料分布在保加利亚、希腊、土耳其、伊拉克和阿塞拜疆，而普通小麦中仅有一个品种Barbilla携带PmWR183等位基因，来自西班牙。

本研究成功克隆了一个来自野生二粒小麦的白粉病抗性位点PmWR183，该位点由一对NLR基因PmWR183-NLR1和PmWR183-NLR2协同控制。这一发现不仅丰富了我们对植物免疫系统中NLR基因对功能的理解，也为小麦抗病育种提供了新的基因资源。特别值得注意的是，PmWR183介导的发育阶段依赖性抗性为研究植物抗病性的时空调控机制提供了理想模型。

研究结果表明，PmWR183-NLR1和PmWR183-NLR2必须协同作用才能赋予小麦对白粉病的完整抗性，单独表达任一基因均不能介导抗性。这种协同作用得到了蛋白质互作实验的进一步支持，证明两个蛋白之间存在直接的物理互作。单倍型分析显示PmWR183-NLR2在LRR结构域表现出极高的氨基酸多样性，这可能通过宿主与病原体之间的持续相互选择而维持。

该研究的创新之处在于揭示了一个罕见且功能协调的NLR基因对，它们共同介导了对小麦白粉病的有效抗性。更重要的是，这种抗性具有发育阶段依赖性，在苗期表现感病而在成株期表现抗性，这为理解植物抗病性的发育调控提供了新的视角。地理分布分析表明PmWR183等位基因在现代小麦育种中尚未被充分利用，因此具有重要的育种应用价值。

总之，这项研究不仅克隆了一个具有重要应用价值的小麦抗病基因，而且深入揭示了NLR基因对在植物免疫中的协同作用机制，为未来小麦抗病育种提供了新的基因资源和理论依据。研究结果强调野生二粒小麦作为优异基因库的重要性，突出了其遗传多样性在小麦育种中的巨大潜力。