mTORC2介导的细胞间相互作用通过促进WNT信号激活调控中内胚层分化

本研究针对mTORC2在早期胚胎发育中的分子机制不明确的问题，通过构建RICTOR基因敲除的人胚胎干细胞模型，发现mTORC2通过调节Rho/Rac信号动态平衡维持细胞黏附，并揭示其缺陷会导致BMP4诱导的WNT信号激活障碍和mesendoderm分化受损。研究首次阐明了mTORC2通过细胞间相互作用调控经典WNT基因表达的新机制，为理解胚胎发育和干细胞命运决定提供了重要见解。

　　

在胚胎发育的奇妙旅程中，细胞命运决定的精确调控始终是发育生物学的核心谜题。 mechanistic target of rapamycin complex 2 (mTORC2) 作为mTOR信号通路的重要组成部分，虽然已知对胚胎发育至关重要，但其在早期发育阶段特别是中内胚层分化过程中的具体作用机制却如雾里看花，不甚清晰。这一知识空白不仅限制了我们对胚胎发育机制的理解，也阻碍了基于干细胞的再生医学发展。

为了揭开这一谜题，来自帝国理工学院的研究团队在《Stem Cell Reports》上发表了最新研究成果。研究人员敏锐地注意到，尽管mTORC2缺失的小鼠胚胎能够在E6.5时期存活并进行原肠胚形成，但组织特异性敲除研究表明mTORC2在原肠胚形成期具有不可替代的功能。这一矛盾现象提示mTORC2可能在早期细胞命运决定中扮演着独特而精细的调控角色。

研究团队首先通过CRISPR-Cas9技术成功构建了RICTOR基因敲除的人胚胎干细胞系，证实mTORC2活性被特异性消除而不影响mTORC1信号。令人惊讶的是，这些突变细胞在特定培养条件下仍能维持自我更新和多能性标记物表达，但在分化过程中却表现出明显的缺陷。

深入机制研究发现，mTORC2缺失导致细胞黏附显著降低，E-cadherin(E-CAD)和ZO1等连接蛋白表达下降，同时RhoA活性异常升高而Rac1-GTP水平降低，破坏了细胞骨架的动态平衡。更关键的是，当研究人员诱导中内胚层分化时，mTORC2缺陷细胞无法有效激活WNT信号通路，即使BMP4处理也无法正常上调WNT3、WNT3A和WNT8A等经典WNT配体的表达。

研究的亮点在于，团队通过巧妙的实验设计证明，直接使用GSK3抑制剂激活WNT信号可完全恢复mTORC2缺陷细胞的mesendoderm分化能力。这不仅确立了mTORC2-WNT信号轴在分化调控中的核心地位，还揭示了细胞间相互作用对于BMP4诱导的WNT基因激活不可或缺。当野生型干细胞以单细胞形式分化时，同样表现出WNT信号激活障碍，进一步佐证了细胞接触在这一过程中的关键作用。

主要技术方法

研究采用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建RICTOR敲除的hESC细胞系，并通过shRNA敲低进行验证。利用RNA测序(RNA-seq)进行转录组分析，结合免疫印迹、免疫荧光等技术评估蛋白表达和定位。通过胚胎体形成和BMP4/Activin A诱导分化模型评估分化潜能，采用G-LISA和pull-down实验检测RhoA/Rac1活性，并利用显微成像技术分析空间信号模式。

RIC-KO hESCs retain the self-renewal and pluripotent marker expression

研究人员发现，虽然RICTOR敲除完全消除了mTORC2活性，但hESCs在鼠胚胎成纤维细胞条件培养基中仍能维持正常的染色体核型、多能性标记物表达和碱性磷酸酶活性。然而在化学成分确定的mTeSR培养基中，RIC-KO hESCs逐渐丧失NANOG表达，表明培养条件对突变细胞的多能性维持具有关键影响。

RIC-KO hESCs exhibit reduced cell adhesion

mTORC2缺陷导致细胞-基质和细胞-细胞相互作用显著受损，表现为细胞贴壁能力下降、E-CAD和ZO1蛋白水平降低以及β-连环蛋白膜定位减少。ROCK抑制剂可部分挽救这一缺陷，机制上源于RhoA活性异常升高和Rac1-GTP水平降低导致的细胞骨架动力学紊乱。

Altered expression of developmental-associated genes in RIC-KO hESCs by RNA-seq

转录组分析显示，RIC-KO hESCs中仅有0.6%的基因表达发生显著改变，但下调基因富集于胚胎发育、中胚层形成和WNT信号通路等关键生物学过程。GATA4、FOXA2、SOX17等重要谱系特异性转录因子表达降低，提示mTORC2可能通过调控发育相关基因影响细胞命运决定。

mTORC2 deficiency impedes mesoderm and endoderm differentiation

胚胎体分化实验表明，RIC-KO细胞中内胚层和中胚层标记物表达显著降低。Activin A诱导的内胚层分化和BMP4诱导的mesendoderm分化均严重受损，表现为BRACHYURY阳性细胞减少和空间模式形成障碍，证实mTORC2对早期谱系分化具有关键调控作用。

Activation of WNT considerably improves mesendoderm differentiation in RIC-KO hESCs

研究人员通过信号通路协同激活实验发现，GSK3抑制剂CHIR99021可完全恢复RIC-KO细胞的mesendoderm分化能力，而Activin A处理则无此效果。这表明mTORC2缺陷特异影响BMP4诱导的WNT信号激活，而非细胞对分化信号的整体反应能力。

BMP4-induced activation of WNT is hampered in RIC-KO hESCs

机制研究表明，BMP4处理可显著上调野生型细胞中WNT3、WNT3A、WNT8A等经典WNT配体表达及其靶基因AXIN2、LEF1，而RIC-KO细胞中这一激活过程严重受损。尽管mTORC2已知通过AKT调控GSK3磷酸化，但研究未检测到GSK3磷酸化水平差异，提示mTORC2可能通过其他机制影响WNT基因表达。

Cell interactions promote BMP4-induced activation of WNT in hESCs

通过比较集落培养和单细胞培养模式，研究证实细胞间接触是BMP4诱导WNT基因激活的必要条件。单细胞培养时，pSMAD1信号分布弥散，WNT配体及其靶基因表达显著降低，而多信号通路协同激活可克服这一缺陷，明确揭示了细胞相互作用在WNT信号启动中的核心地位。

这项研究系统阐明了mTORC2在早期细胞命运决定中的新机制：通过调节Rho/Rac信号平衡维持细胞黏附，进而促进BMP4诱导的经典WNT基因激活和mesendoderm分化。研究不仅解决了mTORC2在胚胎发育中具体功能的长期疑问，更重要的是揭示了细胞间相互作用在WNT信号启动中的关键作用，为理解胚胎发育和干细胞分化提供了新视角。

值得注意的是，mTORC2缺陷细胞表现出的背景依赖性表型——在未分化状态下增殖增强而分化后生长受限，反映了细胞状态特异性信号重编程的能力。这种可塑性既体现了发育调控网络的复杂性，也提示在再生医学应用中需充分考虑细胞微环境的调控作用。

该研究的发现对理解胚胎发育异常和相关疾病具有重要意义，为基于干细胞的疾病建模和药物筛选提供了新思路。未来研究可进一步探索mTORC2如何通过细胞表面受体和细胞黏附分子精确调控WNT基因表达，以及这一机制在不同发育阶段和组织特异性分化中的普适性。