人类诱导多能干细胞工具箱：解析性染色体效应对发育与疾病的调控机制

本刊推荐：为解析性染色体如何独立于性激素调控性别二态性，研究人员通过XXY成纤维细胞重编程构建了常染色体同源且X剂量补偿稳定的人诱导多能干细胞（hiPSCs）工具箱。研究发现XX与XY hiPSCs转录组差异微小，而X单体（XO）则引起广泛转录失调，揭示Y染色体与失活X染色体通过逃逸X失活的X-Y同源基因对自动体基因表达的重要反式调控作用，为性染色体相关疾病机制研究提供了理想模型。

　　

在哺乳动物中，雄性（XY）与雌性（XX）在发育和疾病易感性方面存在显著差异。传统观点将这些差异归因于性激素环境的不同，但最新研究表明性染色体补体本身可直接影响健康与疾病状态下的表型。例如，两条X染色体使女性更易患自身免疫性疾病，而男性Y染色体丢失则与心血管疾病、神经退行性变和癌症风险增加相关。然而，在缺乏性激素的情况下解析性染色体基因如何直接影响发育和疾病易感性，仍是生物学和个性化医学领域的重大挑战。

利用人类诱导多能干细胞（hiPSCs）及其分化衍生物进行体外研究，为探讨性别差异提供了重要平台。但这一体系面临两大挑战：首先，现有的XY和XX hiPSCs系源自不同个体，其常染色体DNA序列的差异会干扰性染色体效应的精准解析；其次，XX hiPSCs常出现X剂量补偿不稳定性，导致X染色体失活（X-inactivation）异常，引发基因表达异常。X剂量补偿通过X染色体与常染色体表达调控（X:A比值接近1.0）和XIST介导的X失活共同实现。研究表明，XX hiPSCs易发生X染色体侵蚀（X-chromosome erosion），即XIST表达丢失导致原本沉默的X基因重新激活，破坏剂量补偿平衡。

为解决上述问题，Francis Crick研究所性染色体生物学实验室的Ruta Meleckyte、Wazeer Varsally等研究人员在《Stem Cell Reports》上发表了题为"A human induced pluripotent stem cell toolbox for studying sex chromosome effects"的研究。该研究通过非嵌合XXY（Klinefelter综合征）成纤维细胞重编程过程中促进性染色体丢失的特性，结合CRISPR-Cas9基因编辑技术，成功构建了常染色体同源、X剂量补偿稳定的XXY、XX、XY及XO（Turner综合征）hiPSCs系，为在体外研究性染色体效应提供了重要资源。

研究人员采用的主要技术方法包括：1）利用无整合重编程技术将非嵌合XXY成纤维细胞转化为hiPSCs，通过自然染色体丢失获得XX和XY细胞系；2）通过CRISPR-Cas9靶向Y染色体着丝粒重复序列，从XY hiPSCs中敲除Y染色体获得XO细胞系；3）综合运用拷贝数变异qPCR、DNA荧光原位杂交（FISH）、核型分析等技术验证性染色体组成和常染色体整倍性；4）通过XIST/ATRX RNA-FISH评估X失活状态，筛选具有稳定XIST云和单等位基因表达的细胞系；5）利用批量RNA测序（RNA-seq）进行转录组分析，比较不同基因型hiPSCs的基因表达差异。

生成和表征常染色体同源的XXY、XX、XY和XO hiPSCs

研究团队通过对非嵌合XXY成纤维细胞进行重编程，利用该过程中性染色体易丢失的特性，获得Y染色体丢失产生的XX hiPSCs和X染色体丢失产生的XY hiPSCs。随后，通过CRISPR-Cas9靶向Y染色体着丝粒重复区域，从XY hiPSCs中消除Y染色体获得XO细胞系。拷贝数变异qPCR和DNA-FISH证实了XXY、XX、XY和XO hiPSCs的性染色体组成，核型分析表明它们均为常染色体整倍体。通过等位基因平衡分析及XIST/ATRX RNA-FISH筛选，研究人员确保了XXY和XX hiPSCs克隆具有高效的X失活功能，且无X染色体侵蚀现象。所有hiPSCs系均表达未分化状态标志物POU5F1（OCT4）和NANOG，并具有向三胚层分化的能力。

XX与XY iPSCs之间基因表达差异极小

转录组分析显示，基于性连锁基因的主成分分析（PCA）中，细胞按性染色体组成（XXY、XX、XY、XO）明显分离。然而，当使用全部基因或仅常染色体基因进行PCA时，XXY、XX和XY hiPSCs彼此聚集紧密，而与XO hiPSCs距离较远，表明性染色体以反式作用方式影响常染色体基因表达，且X单体对常染色体转录组有显著影响。XX与XY hiPSCs之间仅存在82个差异表达基因（DEGs），其中33个为性连锁（26个Y连锁，7个X连锁），说明两者转录组高度相似。XX hiPSCs中高表达的基因包括已知逃逸X失活的基因（如XIST、KDM6A等），而XY hiPSCs中上调的基因主要为Y连锁（87%），这些基因多参与染色质修饰、RNA稳定性和翻译等调控功能。X:A比值分析证实XX和XY hiPSCs均实现了完全的X剂量补偿（比值接近1.0）。

性染色体单体显著影响hiPSCs基因表达

XXY hiPSCs的转录组与XX和XY hiPSCs相似，而XO hiPSCs则表现出广泛的转录失调。XY与XO比较中发现2483个DEGs，XX与XO比较中有2365个DEGs，其中95%为常染色体基因，表明Y染色体和失活X染色体的缺失均会显著影响常染色体转录组，且这种影响具有细胞类型特异性。

Y染色体和失活X染色体在hiPSCs中具有共同靶点

XY vs XO和XX vs XO的DEGs存在高度显著的重叠（73%-76%），功能富集分析显示这些共同靶基因参与细胞运动、粘附和神经发生等通路。研究表明，这种调控可能由在进化中高度保守、剂量敏感的X-Y同源基因对（如DDX3X/DDX3Y、KDM5C/KDM5D等）介导，这些基因的X同源物可逃逸X失活。

本研究构建的常染色体同源hiPSCs工具箱解决了以往研究中个体间常染色体变异和X剂量补偿不稳定的问题，为精确解析性染色体效应提供了可靠模型。研究发现XX与XY hiPSCs转录组差异微小，强调了Y染色体与失活X染色体在调控基因表达中的功能相似性。而X单体引起的广泛转录失调，则揭示了性染色体通过古老X-Y同源基因对维持基因表达稳态的重要性。这些发现不仅为理解特纳综合征等高流产率及多种临床表现的分子机制提供了线索，也为在特定细胞类型和类器官中研究性染色体相关疾病及开发靶向疗法奠定了基础。该资源未来可通过补充不同遗传背景的等基因系，进一步推动性别特异性医学研究的发展。