利用CRISPR-Cas9基因组编辑靶向致癌融合基因驱动的NUT癌

本研究针对目前缺乏有效治疗手段的NUT癌（NC），通过CRISPR-Cas9技术特异性靶向BRD4::NUTM1融合基因，成功在体外模型中实现融合蛋白的敲除，显著抑制了肿瘤细胞的增殖能力并诱导细胞周期阻滞和凋亡。该研究为融合基因驱动的恶性肿瘤提供了新的精准治疗策略。

　　

NUT癌（NUT Carcinoma, NC）是一种罕见但极具侵袭性的恶性肿瘤，患者中位生存期仅6-7个月。这种癌症的特征是NUTM1基因与伴侣基因（最常见的是BRD4或BRD3）发生融合，产生致癌融合蛋白，通过重塑表观遗传景观驱动肿瘤发生。目前手术、化疗和放疗效果有限，迫切需要新的治疗方法。

以往研究尝试使用BET抑制剂（BETi）靶向BRD4-NUT融合蛋白，但临床疗效有限。由于NUT蛋白通常仅在生殖细胞中表达，因此成为NC治疗的理想靶点。然而，目前尚无直接靶向NUT的分子抑制剂，而RNA干扰和蛋白降解技术等方法的效果是可逆的。CRISPR-Cas9基因编辑技术能够直接在DNA水平上永久性地破坏致癌融合基因，为治疗NC提供了新思路。

在这项发表于《Molecular Therapy Oncology》的研究中，研究人员探索了使用CRISPR-Cas9技术特异性靶向BRD4::NUTM1融合基因治疗NC的可行性。他们设计了针对BRD4和NUTM1不同外显子的单导RNA（sgRNA），在两种NC细胞系（HCC2429和143100）中进行了系统研究。

研究采用的关键技术方法包括：通过MaxCyte ExPERT GTx电穿孔仪优化细胞转染条件；设计针对BRD4外显子2、NUTM1外显子3（融合区内）和NUTM1外显子2（融合区外，作为对照）的sgRNA；使用Sanger测序和Synthego ICE软件分析基因编辑效率；通过蛋白质印迹（Western Blot）验证融合蛋白敲除效果；采用SRB法、集落形成实验和xCELLigence实时细胞分析系统评估细胞增殖和活力；利用流式细胞术进行细胞周期和凋亡分析；通过全基因组测序进行脱靶效应分析。

CRISPR靶向策略和sgRNA设计

研究人员设计了针对三个不同外显子的sgRNA：两个靶向NUTM1外显子2（位于融合基因外，作为阴性对照），三个靶向NUTM1外显子3，三个靶向BRD4外显子2（均位于融合基因内）。优先选择早期外显子以实现最高可能性的移码突变。

NUT癌细胞电穿孔

通过优化电穿孔条件，在NC细胞系HCC2429、143100和SNU-3178S以及NSCLC细胞系A549中实现了超过95%的转染效率，为后续实验奠定了基础。

不同sgRNA的优化

在A549细胞中测试了8种sgRNA的编辑效率，最终选择了NUTM1外显子2的sgRNA-1（缺失71%，敲除66%）、NUTM1外显子3的sgRNA-5（缺失93%，敲除92%）和BRD4外显子2的sgRNA-7（缺失85%，敲除81%）用于后续实验。

增殖和活力测定

SRB实验显示，靶向NUTM1外显子3的基因编辑将HCC2429和143100细胞的蛋白质质量分别减少至19.6%和9.9%；靶向BRD4外显子2的编辑分别减少至27.0%和19.6%。集落形成实验进一步证实了基因编辑对NC细胞增殖能力的显著抑制。xCELLigence实时监测显示，靶向融合基因的编辑显著降低了细胞生长速率。

BRD4::NUT融合蛋白敲除的验证

Western Blot分析证实，靶向NUTM1外显子3或BRD4外显子2的基因编辑能有效降低BRD4::NUT融合蛋白水平，并显著下调关键癌基因c-Myc的表达。免疫荧光显微镜显示，基因编辑后NUT蛋白的核内斑点状分布完全消失。

细胞周期和凋亡分析

流式细胞术显示，基因编辑导致NC细胞发生G1期阻滞，HCC2429和143100细胞的G2期比例显著降低。 annexin V/PI染色表明，HCC2429细胞在基因编辑后早期和晚期凋亡细胞比例显著增加。

脱靶分析

通过全基因组测序评估了NUTM1外显子3的sgRNA-5的脱靶效应。在分析的1,098个预测脱靶位点中，仅发现少量低频率的indel，且均位于非编码区，表明使用的sgRNA具有较高特异性。

研究结果表明，CRISPR-Cas9介导的BRD4::NUTM1融合基因破坏能有效抑制NC细胞的增殖，这一效应与细胞周期阻滞和凋亡诱导相关。基因编辑导致融合蛋白敲除和下游c-Myc信号抑制，证实了NC细胞对BRD4::NUTM1融合基因的依赖性。

尽管基因编辑效果在14天内逐渐减弱（由于未编辑细胞的快速生长），但研究证实了靶向致癌融合基因的治疗潜力。与靶向BRD4相比，靶向NUTM1具有更好的安全性，因为NUTM1的表达主要局限于睾丸组织。脱靶分析显示使用的sgRNA具有高度特异性，为临床转化提供了安全性依据。

该研究不仅为NC提供了新的治疗策略，也为其他融合基因驱动的癌症（如CML、AML和Ewing肉瘤）的治疗开辟了新途径。未来研究可探索通过溶瘤病毒递送CRISPR-Cas9组件，或结合基因编辑与免疫治疗策略，进一步提高治疗效果。尽管在体递送和完全基因破坏方面仍面临挑战，但本研究为开发高度特异性的癌症基因治疗奠定了基础。