CRISPR/Cas9介导t(4;11)易位在人造血干/祖细胞中的谱系可塑性研究揭示KMT2A重排白血病早期发生机制

本研究针对KMTZ-r白血病发病早期分子机制不明的瓶颈问题，利用CRISPR/Cas9技术在脐带血CD34+造血干/祖细胞中精准诱导t(4;11)染色体易位，成功构建同时表达KMT2A::AFF1和AFF1::KMT2A融合蛋白的体外模型。研究发现易位细胞在IL-7刺激下可分化为CD19+淋系和CD19-髓系群体，基因表达谱与患者样本高度吻合，为揭示白血病起始细胞的可塑性调控提供了新视角。

　　

当科学家们试图解开白血病发病的最早谜团时，常常会遭遇一个关键障碍：如何捕捉正常细胞向癌变细胞转化的"决定性瞬间"。在KMT2A重排（KMT2A-r）急性白血病中，这个问题尤为突出。虽然医学界早已发现t(4;11)(q21;q23)染色体易位是这类白血病的重要标志，产生KMT2A::AFF1和AFF1::KMT2A两种融合蛋白，但它们在疾病起始阶段的具体作用机制仍是一个"黑箱"。传统研究方法如小鼠移植模型或细胞系研究，无法实时观察人类造血干/祖细胞（HSPCs）从正常状态到前白血病细胞，最终成为白血病起始细胞（LICs）的完整转化过程。

这项发表在《Leukemia》的研究突破性地利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在人类脐带血来源的CD34⁺造血干/祖细胞中精准模拟了t(4;11)染色体易位，成功创建了一个能够长期体外培养的疾病模型。研究人员通过分子监测发现，这些基因编辑细胞不仅同时表达两种 reciprocal 融合蛋白，更重要的是，它们展现出惊人的谱系可塑性——在单一细胞因子IL-7的刺激下，能够分化为髓系或淋巴系细胞，为理解白血病早期发生提供了前所未有的观察窗口。

关键技术方法概述

研究团队从脐带血中分离CD34⁺造血干/祖细胞，通过电转染预组装的Cas9-sgRNA核糖核蛋白（RNPs），靶向KMT2A基因内含子9和AFF1基因内含子3，诱导特异性染色体易位。细胞长期培养过程中，利用流式细胞术监测表面标志物（如CD19、CD33、CD45等），并通过RT-PCR、Western blot、基因表达谱（MACE-Seq）和荧光原位杂交（FISH）等多维度技术验证融合基因表达和细胞特性。

研究结果

CRISPR/Cas9编辑及染色体易位诱导具有增殖依赖性

研究发现，染色体易位的成功诱导与细胞增殖状态密切相关。在培养第2天进行电转染时，可获得近5%的t(4;11)易位效率，而第0天和第1天的编辑均未成功。流式细胞术分析显示，虽然培养前两日细胞未发生分裂，但CD34⁺CD38^-细胞群已从最初的造血干细胞（HSCs）和多功能祖细胞（MPPs）为主，分化为包括MPP、淋巴髓系祖细胞（LMPP）、粒细胞-单核细胞祖细胞（GMP）等在内的多种祖细胞群体。

脐带血HSPCs体外长期培养体系的建立

经CRISPR/Cas9编辑的细胞可与未编辑细胞共培养，约30天后，t(4;11)易位细胞几乎完全取代未编辑细胞（纯度近100%）。未编辑细胞在培养8周后活力丧失，而易位细胞从第2周起稳定扩增，最长培养至170天。融合转录本水平随时间增加，第30天达到稳定，Western blot证实KMT2A::AFF1融合蛋白（约245 kDa）的表达。

克隆性分析揭示亚克隆随时间演化

gDNA克隆性分析显示，编辑初期（第7天）存在10个不同亚克隆，随培养时间延长，优势克隆逐渐筛选，至第70天仅剩1个主导克隆。该最终克隆在KMT2A内含子9和AFF1内含子3连接处含有一个由非同源末端连接（NHEJ）修复插入的额外A核苷酸。

流式细胞术分析显示IL-7介导的CD19表面表达

IL-7刺激40天后，t(4;11)细胞中CD19⁺群体从第2天的0.07%增至第44天的6.75%。第70天，CD19⁺细胞（约6%）与CD19^-细胞（约94%）经MACS分选后，基因表达分析显示CD19⁺群体特异性高表达PAX5（83.4 tpm）、CD19（180.3 tpm）等B细胞相关基因，而CD19^-群体保持髓系特征。表型分析证实CD19⁺细胞共表达CD33但不表达CD20，符合t(4;11)白血病患者的pro-B表型特征。

基因表达谱分析

基因表达分析显示，第70天的CD19^-群体与早期GMP、中性粒细胞/单核细胞发育高度相似，而CD19⁺群体则与淋巴髓系祖细胞（LMPP）、常见淋巴样祖细胞（CLP）和早期B细胞特征重叠。与t(4;11)婴儿和非婴儿白血病患者数据比较，CD19⁺群体的基因签名与患者样本存在显著重叠（上调基因重叠度74-86%）。白血病干细胞（LSC）特征基因分析发现，CD19⁺群体重新表达SOCS2、CDK6等干细胞相关基因。

研究结论与意义

本研究首次在人类原代造血干/祖细胞中利用CRISPR/Cas9技术成功构建了t(4;11)染色体易位模型，证实了KMT2A重排细胞在体外具有双向分化潜能。这一模型能够模拟从正常细胞向前白血病细胞（CD19^-）乃至白血病样细胞（CD19⁺）的转变过程，为研究KMT2A-r白血病发病机制提供了强大平台。研究发现IL-7单一因子即可诱导部分细胞向淋系分化，揭示了白血病起始细胞在特定微环境信号下的可塑性。该技术突破了传统动物模型的局限性，使实时分子监测成为可能，为开发靶向白血病早期事件的治疗策略奠定了坚实基础。