用于基因解码和菌株工程的基因组规模CRISPRi及碱基编辑文库在Shewanella中的应用

CRISPR技术用于改造电化学合成微生物Shewanella oneidensis MR-1，构建了干扰、突变和失活三种基因编辑库，首次发现必要基因并扩展其电化学合成底物至葡萄糖和甲壳素。

　　

技术成熟度

本研究设计并构建的基于规律间隔短回文重复序列（CRISPR）的文库已达到4级技术成熟度（TRL）。虽然核心概念已在实验室条件下得到验证，但在全面应用之前仍需解决若干挑战。主要限制之一是缺乏专门针对电活性微生物（尤其是那些能够选择所需细胞外电子转移特性的微生物）的高效筛选方法。现有的筛选方法主要基于微生物生长情况，无法充分反映其电活性特征。此外，微生物燃料电池的实际应用受到单细胞发电效率低的限制，这需要进一步提高才能实现大规模部署。此外，监管规定禁止将基因改造后的微生物直接释放到环境中，例如在需要生物修复的重金属污染问题中。具体来说，表达质粒的菌株不能被释放。为应对这一挑战，需要进行基因组级别的修饰，因为这可以实现更稳定和可控的基因改变。从文库筛选中鉴定出的目标基因可能与特定表型特征相关，但这些基因并不能保证达到最佳表达水平。因此，精确控制基因表达水平至关重要。这需要开发具有高精度的先进调控元件，以将基因表达调整到有效生物修复所需的水平。随着筛选方法和基因组水平基因表达控制的进一步发展，这项技术有望达到5-6级技术成熟度，从而开启Shewanella oneidensis在微生物燃料电池和生物修复中的应用。

亮点

Shewanella oneidensis是一种广泛用于微生物燃料电池和生物修复的电活性微生物，本研究为其配备了基因组级别的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）文库，用于功能基因组学研究。

CRISPR干扰（CRISPRi）文库能够在有氧和无氧条件下实现全基因组转录抑制，以识别潜在的关键基因。

碱基编辑文库在代谢基因中引入突变或提前终止密码子，扩展了可用于发电的底物范围，包括葡萄糖和几丁质。

基于接合的转化策略确保了单个引导RNA的高覆盖率和均匀分布，为转化效率较低的物种提供了可扩展的平台。

互补的扰动策略揭示了微生物特征的不同调控层次，为电活性微生物的高通量功能基因组学研究建立了多功能框架。

摘要

基于规律间隔短回文重复序列（CRISPR）的文库具有多种基因编辑功能，如基因敲低和突变，可以显著加速我们对微生物复杂代谢网络的理解，尤其是对于传统模式生物以外的物种。本研究在电活性微生物Shewanella oneidensis MR-1中设计了三种不同的CRISPR文库：一个覆盖99.6%基因组的CRISPR干扰（CRISPRi）文库、一个针对碳代谢相关基因的蛋白质突变文库，以及一个失活文库，其包含的单一引导RNA数量分别为30,804个、5,963个和4,072个。文库的设计和构建原理得到了验证，并开发了一种基于接合的转化方法，具有高覆盖率和均匀性。我们首次探索了S. oneidensis MR-1的潜在关键基因，并扩展了可用于发电的底物范围，包括葡萄糖和几丁质。这些努力使得对Shewanella的基因组研究更加深入，并为将基于CRISPR的工具应用于其他特征不明确的微生物物种提供了框架。

图形摘要