基于crRNA表达的梨火疫病菌基因编辑新方法构建及其在致病机理研究中的应用

本研究针对梨火疫病菌(Erwinia amylovora)缺乏有效基因组编辑工具的问题，开发了一种基于内源I-E型CRISPR/Cas系统的基因敲除方法。研究人员通过构建crRNA表达质粒，成功实现了pEA29质粒消除和ams操纵子大片段缺失突变体的构建。全基因组测序结果显示该方法能产生33.1-51.5kb的大片段缺失，且未检测到脱靶效应。该方法为梨火疫病菌功能基因组学研究提供了重要技术支撑。

　　

梨火疫病是一种严重危害蔷薇科果树的毁灭性病害，其病原菌——梨火疫病菌(Erwinia amylovora)被列为十大植物病原菌之一，能够侵染蔷薇科40个属的220多种植物。该病菌对梨树、苹果树、山楂等重要经济果树造成严重威胁，其致病性主要受III型分泌系统(T3SS)、胞外多糖(EPS)和生物膜等因素的影响。其中，淀粉欧兰(amylovoran)作为主要的胞外多糖成分，其合成涉及12个基因组成的ams操纵子。此外，普遍存在于梨火疫病菌中的pEA29质粒也参与淀粉欧兰的生物合成和植物体内生物膜的形成。

长期以来，研究细菌基因功能离不开失活突变体的构建。虽然CRISPR/Cas基因组编辑技术已在多种模式生物中广泛应用，但梨火疫病菌仍缺乏有效的基因组编辑工具。以往研究中，Tn5转座子诱变和Red同源重组系统曾被用于构建梨火疫病菌突变体，而CRISPR系统仅用于构建质粒消除突变株，尚未实现基因组编辑。梨火疫病菌的内源CRISPR系统属于I-E型，其原型间隔相邻基序(PAM)序列为AAG。该系统通过Cas3酶介导的DNA切割导致大片段缺失，为基因组编辑提供了可能。

本研究基于梨火疫病菌内源CRISPR系统，开发了一种简单有效的基因敲除方法。研究人员主要运用了质粒构建、电转化、多重PCR检测、全基因组测序、淀粉欧兰产量测定、植物致病性实验和噬菌体感染实验等关键技术方法。其中使用的梨火疫病菌菌株Ea915和Ea102以及噬菌体Kuerle均分离自新疆库尔勒地区。

Construction of the CRISPR array expression vectors

研究人员选择效率更高的CRR1阵列构建CRISPR阵列表达载体。将合成的CRR1表达盒和pEA60质粒复制起始区插入pMD19的多克隆位点，构建了CRISPR阵列表达载体pEaCR1。为便于间隔区插入，在表达盒的CRR1启动子下游引入了两个AarI酶切位点。基于pEaCR1构建了pEaCRK和pEaCRA两个质粒，分别靶向pEA29质粒/噬菌体Kuerle和ams操纵子区域。

crRNA expression mediated curing of plasmid pEA29 in E.amylvora

将pEaCRK电转入Ea915菌株后，通过多重PCR检测发现10个转化子中有9个消除了pEA29质粒，消除效率达90%。质粒消除后的菌株在无氨苄青霉素培养基中培养可获得Ea915^ΔpEA29菌株。

crRNA expression mediated large fragment knockout of ams operon in E.amylovora

将pEaCRA电转入Ea915后，通过PCR筛选发现存在大规模基因组缺失(>4.2kb)的转化子。对11个独立转化子进行全基因组测序，鉴定出5种不同的缺失事件，缺失片段大小在33.1-51.5kb之间，缺失边界在crRNA靶位点两侧各不相同，且未检测到脱靶效应。

Plasmid curing of pEA29 reduces amylovoran biosynthesis and pathogenicity

pEA29质粒消除突变体的淀粉欧兰产量降至野生型Ea915的73%。在幼梨和梨苗上的致病性实验表明，Ea915^ΔpEA29引起的变黑、细菌脓液和萎蔫症状显著减轻。

The ams operon deletion mutants impair amylvoran biosynthesis and has no pathogenicity in planta

ams操纵子缺失突变体Ea915^ΔpEA29Δams的淀粉欧兰产量极低，在幼梨和梨苗上不引起任何病害症状，与PBS对照相当。

crRNA expression in E. amylovora does not reduce phage Kuerle infection

表达靶向噬菌体Kuerle的crRNA并不影响噬菌体感染效率，噬菌体斑形态和数量与对照无显著差异。

本研究成功开发了一种基于内源CRISPR系统的梨火疫病菌基因编辑方法，实现了质粒消除和基因组大片段缺失。该方法利用内源Cas蛋白通过工程化crRNA表达介导基因组编辑，避免了外源Cas蛋白的引入。值得注意的是，该方法在靶向ams操纵子时产生了边界可变的大规模缺失，这与Cas3酶的过程性核酸酶活性有关。虽然目前产生的是随机缺失而非精确编辑，但未来通过提供修复片段诱导同源重组，有望提高靶向基因编辑的精确性。

该研究建立的基因编辑技术为梨火疫病菌功能基因组学研究提供了重要工具，有助于加速毒力因子鉴定和火疫病防控研究。该方法可应用于基因操纵子编辑和基因组中大型未知功能区域的分析，对深入理解梨火疫病菌致病机制具有重要意义。