CRISPR代谢工程双效提升镰刀菌蛋白营养与可持续性

本研究针对传统真菌蛋白营养效价低、底物转化率不足及环境负担较重等问题，通过CRISPR/Cas9介导的无疤痕基因敲除技术对Fusarium venenatum进行代谢工程改造。研究成功构建了FCPD工程菌株，其必需氨基酸指数（EAAI）提升32.9%，底物消耗降低44.3%，蛋白质转化率提高至野生型的2.24倍。基于工业规模数据的生命周期评估（LCA）显示，在六国生产情景下FCPD可降低全球变暖潜能（GWP）4-61.3%，且环境表现优于细胞培养肉与鸡肉。该工作为基因编辑技术同步提升替代蛋白营养价值与环境可持续性提供了实证。

　　

随着全球人口持续增长和饮食结构变化，传统畜牧业正面临严峻的可持续发展挑战。畜牧业不仅占据约40%的农业用地，更贡献了全球温室气体排放量的14.5%。这种环境压力与日益突出的粮食安全问题，共同加速了人们对替代蛋白源的探索。在众多替代蛋白中，源自Fusarium venenatum（镰刀菌）的真菌蛋白（Mycoprotein，MP）展现出独特潜力，已在美国、欧盟和澳大利亚等多个国家和地区获准用于人类消费。生命周期评估（LCA）数据表明，以糖为基础的MP相较于传统动物蛋白具有显著环境优势，能降低约80%的温室气体排放和超过90%的土地使用。然而，一个显著的研究空白依然存在：工业规模MP生产的环境影响，特别是在土地利用、发酵引起的水体富营养化以及能源相关的全球变暖潜能（GWP）方面，尚未得到充分表征。此外，传统MP生产菌株（尤其是Fusarium venenatum）存在碳氮代谢流分散、底物转化率低等问题，限制了其生产效率。MP产品的营养价值，特别是其细胞壁结构可能影响细胞内营养物质（如蛋白质）的生物可及性，进而影响消化吸收，也是需要关注的重点。

为了应对这些挑战，并致力于实现联合国2030年可持续发展目标（SDGs），江南大学未来食品科学中心、食品合成生物技术教育部工程研究中心及生物技术学院的吴晓慧、王梦茹、罗时军、周治彤、王亚男、堵国成、陈坚和刘潇（通讯作者）的研究团队在《Trends in Biotechnology》上发表了题为“Dual enhancement of mycoprotein nutrition and sustainability via CRISPR-mediated metabolic engineering of Fusarium venenatum”的研究。该研究旨在利用CRISPR/Cas9无疤痕基因敲除技术，创制一种具有高葡萄糖转化率和增强营养价值的F. venenatum菌株FCPD，并采用从摇篮到大门（cradle-to-gate）的LCA方法评估FCPD-MP生产的环境影响，同时与其他替代蛋白产品（如豌豆蛋白香肠和细胞培养肉）以及鸡肉生产进行比较。

研究人员主要运用了几项关键技术方法：首先，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对Fusarium venenatum野生型菌株进行几丁质合成酶（Chs）和丙酮酸脱羧酶的双基因无疤痕敲除，构建工程菌株FCPD。其次，在江西富曦生物科技有限公司进行了工业规模（5000升发酵罐）的连续发酵，以验证菌株的生产性能。第三，结合转录组学和代谢组学分析，探究基因敲除对菌株基因表达和代谢谱的影响。第四，采用体外动态模拟胃肠道消化系统评估MP的消化特性。第五，基于工业试验数据，建立生命周期评估（LCA）模型，使用SimaPro软件和ReCiPe 2016中点（H）方法，评估了在不同国家（中国、芬兰、美国、波兰、荷兰、英国以及中国低碳情景）生产情景下MP的环境影响，并与豌豆蛋白香肠、细胞培养肉和鸡肉进行比较，同时进行了蒙特卡洛（MC）不确定性分析和敏感性分析。

营养特性和工业发酵性能

研究首先比较了工程菌株FCPD与野生型（WT）的MP特性。真菌细胞壁的主要结构成分包括β-1,3-葡聚糖、β-1,6-葡聚糖和几丁质。几丁质合成酶（Chs）位于质膜上，负责合成几丁质。坚韧的细胞壁可能限制细胞内营养物质的生物可及性。

-1 MP产品）。(J)5000升发酵罐上的葡萄糖-蛋白质转化率。(K)5000升发酵罐上的MP产率。(L)5000升发酵罐培养18小时后发酵液状态。(M)包装灭菌后的WT-MP和FCPD-MP产品图像。(N)热处理前菌丝微观结构，蛋白质染成绿色，细胞壁染成蓝色。'>

通过同时敲除WT F. venenatum中的几丁质合成酶（Chs）和丙酮酸脱羧酶，研究人员成功构建了FCPD菌株。PCR验证和测序结果证实两个靶基因均被成功无疤痕敲除。研究发现，在热处理（用于降低RNA含量）前，FCPD的几丁质含量比WT菌株降低了29%。但热处理后，大量细胞内容物释放，导致几丁质相对含量显著增加，FCPD最终MP产品中的几丁质含量为20.78%。蛋白质含量和总膳食纤维含量也表现出类似现象。未加热时，FCPD的蛋白质含量比WT高17.13%；然而热处理后，WT的蛋白质含量上升至高达59.8%，推测可能与WT细胞泄漏更多细胞内容物有关。体外模拟胃肠道消化显示，尽管FCPD的总体蛋白质消化率较低，但其在必需氨基酸评分（EAAS）和必需氨基酸指数（EAAI）方面表现优于WT。这种差异可能源于敲除引起的菌丝宏观特性变化导致的消化动力学改变。菌丝微观染色进一步证实了结构改变，与WT相比，FCPD菌株的亮斑减弱，细胞壁变薄。

在工业规模发酵过程中，WT和FCPD菌株在发酵液中均呈现浓厚的丝状簇形态。FCPD菌株在达到相同生物量产出时，比WT菌株少消耗约44%的底物葡萄糖。该菌株的葡萄糖-蛋白质转化率显著提高，达到WT菌株的2.24倍，同时MP产率提高了88.4%。

整合转录组与代谢组分析

为探究Chs和丙酮酸脱羧酶基因敲除对F. venenatum基因表达和代谢谱的影响，研究人员对WT和FCPD菌株进行了整合转录组学和代谢组学分析。

通过分析，共鉴定出1076个差异表达基因（DEGs）和478个差异表达代谢物（DEMs）。这些DEGs和DEMs显著富集在六条共同的关键代谢相关KEGG通路中，即“代谢通路”、“牛磺酸和亚牛磺酸代谢”、“碳代谢”、“丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢”、“苯丙氨酸代谢”以及“丁酸酯代谢”。糖酵解/糖异生通路在FCPD中显著下调，与碳氮代谢相关的基因也表现出下调。由于葡萄糖代谢的主要过程是糖酵解，FCPD中观察到的葡萄糖消耗速率降低可能是糖酵解通路下调的结果。这些发现表明，敲除Chs和丙酮酸脱羧酶基因主要影响多种氨基酸的生物合成，并通过TCA循环（三羧酸循环）调节碳代谢。与先前研究一致，敲除F. venenatum中的丙酮酸脱羧酶增强了糖异生通路，同时节约了来自丙酮酸的碳流。拓扑分析显示，差异代谢物主要集中在与氨基酸代谢或生物合成相关的多条通路中，包括“精氨酸生物合成”、“丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢”和“苯丙氨酸代谢”。其他重要通路，如与TCA循环和糖异生通路相关的“氮代谢”和“泛酸和CoA生物合成”也被识别出来。

FCPD生产效率的工业规模验证及不同情景下的环境优势

鉴于FCPD通过提高生产率、大幅节约底物以及菌丝体中无不良代谢物积累来增强MP生产，研究人员评估了其在真实工业水平生产中的性能和环境效益。

基于各国能源结构的差异，研究人员选择了八个生产情景进行评估。结果显示，与WT-MP生产相比，在八个情景下，生产每公斤FCPD-MP可降低环境影响，如GWP降低幅度在4%至61.3%之间。葡萄糖投入在大多数影响类别中占比最高，范围从19.64%到99.38%，具体取决于影响类别和国家。葡萄糖的贡献在土地用途方面最为明显（97.9-99.38%），表明了农产品对土地的依赖性。此外，对于GWP，葡萄糖的贡献为48.48-67.32%，其次是电力（5.67-29.47%）和蒸汽（19.38-28.21%）。在某些情景下，电力对淡水富营养化和电离辐射的影响超过了葡萄糖。由于每公斤FCPD产品节省了超过40%的底物葡萄糖，这在几乎所有影响类别中都产生了显著的积极影响。

不同国家结果的差异部分归因于其不同的发电结构。例如，中国和波兰等国对硬煤依赖显著。而当转向低碳情景时，电力对GWP的总体贡献呈下降趋势。然而，电离辐射是一个例外，在芬兰等清洁能源结构的国家，MP生产所用电力引起的电离辐射占比高达68.31-76.73%。

FCPD-MP与其他蛋白产品的比较

研究人员进一步比较了FCPD-MP与其它广泛使用的替代蛋白产品（如植物蛋白和细胞培养肉）以及真实动物肉产品（鸡肉）的环境影响。

以1公斤类肉产品为功能单位，重新建模和比较分析表明，植物蛋白食品（豌豆蛋白香肠）的生产在所有影响类别中的环境影响均低于MP、细胞培养肉和动物肉产品。通过减少发酵过程中葡萄糖等营养物质的用量，基因编辑MP在多个类别（如GWP、土地用途、平流层臭氧消耗、陆地酸化和淡水富营养化潜能）上显示出优于鸡肉的优势。细胞培养肉产品在许多影响类别（如GWP、陆地生态毒性和水资源稀缺）中影响最大。FCPD-MP和细胞培养肉的生产有一些共同点（例如，都高度依赖工业投入），葡萄糖和电力占贡献的大部分。总体而言，生产FCPD-MP作为动物肉蛋白的替代品具有显著的环境效益。

FCPD-MP模型结果的敏感性分析

通过对LCA模型中最相关的输入变量（电力、蒸汽、葡萄糖、自来水）进行±20%的变动来评估敏感性。

结果显示，大多数输入的变化对FCPD-MP产出的总体估计影响轻微。电力消耗增加20%仅导致环境影响增加0.21-6.5%。在所有类别中，增加自来水输入的环境影响将小于0.8%。相反，葡萄糖输入增加20%会导致环境影响增加9.69-19.84%。敏感性分析和特定不确定性范围（±10%）增强了结果对不同情况的适应性。

研究结论与意义

本研究提供了令人信服的证据，表明基于CRISPR/Cas的技术是一种强大的基因编辑工具，可同时增强MP的营养特性和可持续性。通过CRISPR/Cas9无疤痕基因敲除技术，成功构建了Fusarium venenatum工程菌株FCPD。该菌株通过靶向截断竞争性代谢通路和调节氨基酸代谢或生物合成，使必需氨基酸指数（EAAI）提高了32.9%。在工业发酵规模下，FCPD在提高MP产率88.4%的同时，底物消耗降低了44.3%，葡萄糖-蛋白质转化率达到WT的2.24倍。

生命周期评估表明，FCPD-MP生产在多种环境影响类别上均优于WT菌株，并且在多个国家情景下均表现出环境友好性。与鸡肉和细胞培养肉相比，FCPD-MP在GWP、土地占用等多个方面具有环境优势。该研究建立了CRISPR/Cas技术和代谢工程作为在替代蛋白生产中实现营养增强和环境影响减缓的双重用途工具。

值得注意的是，MP生产过程中热处理导致的生物量损失（约65%）以及葡萄糖投入是环境影响的主要贡献者。未来研究可探索利用各种废物流作为MP发酵底物等可持续实践。此外，基因编辑食品（不含有外源DNA）与转基因生物（GMOs）的监管框架存在差异，CRISPR/Cas9等无疤痕基因编辑技术的应用及其“天然”特性和优越品质，需要政策制定者适当引导和沟通，以促进其发展。

这项工作为推动替代蛋白产业的长期发展提供了重要支持，展示了基因编辑技术在应对全球蛋白质短缺和可持续发展挑战方面的巨大潜力。