利用CRISPR-Cas9文库靶向水稻推定冗余基因集以探索其在籽粒发育中的功能

本研究针对水稻中因基因冗余导致的功能解析难题，开发了一种基于CRISPR-Cas9的高通量高阶敲除文库策略。研究人员通过生物信息学分析鉴定了3790个推定冗余基因集，并构建了10个组织特异性CRISPR-Cas9质粒文库。以种子表达基因库为例，成功获得编辑效率达91%的T0代植株，其中约75%为高阶敲除突变体。T1代表型分析揭示了多个种子特异性基因在调控粒长、粒宽、粒重及产量方面的 novel 功能，并发现两个Agenet结构域蛋白基因（LOC_Os09g24290 和 LOC_Os10g26430）存在上位性互作。该研究为克服植物功能基因组学研究中的基因冗余障碍提供了高效技术平台。

　　

在水稻功能基因组学研究中，基因重复现象普遍存在，约60%的基因拥有旁系同源拷贝。这些冗余基因虽然增强了生物的适应性，却为功能解析带来了巨大挑战——单个基因的敲除往往因功能补偿而无法呈现表型。传统突变体创制方法如化学诱变、T-DNA插入等效率有限，且难以实现多基因同步敲除。CRISPR-Cas9技术的出现为高通量靶向突变提供了新机遇，但其在水稻中应用于高阶敲除的研究尚属空白。

为攻克这一难题，Banita Yadav等研究人员在《BMC Plant Biology》发表了题为“A CRISPR-Cas9 library to target putative redundant gene sets facilitates their functional exploration in grain development in rice”的研究论文。团队基于蛋白序列相似性和共表达分析，从水稻基因组中筛选出3790个推定冗余基因集，并创新性地构建了10个组织特异性CRISPR-Cas9质粒文库。通过农杆菌介导的遗传转化，将种子特异性表达基因库（Group#1）导入水稻，成功获得高阶敲除突变体群体。

研究采用的核心技术包括：基于CAFRI-Rice数据库的冗余基因集生物信息学筛选、CRISPR MultiTargeter工具的sgRNA（单链引导RNA）设计、基于BsaI酶切的文库构建技术、Illumina NovaSeq 6000平台的二代测序验证、农杆菌介导的水稻遗传转化（品种包括MTU-1010和TP-309），以及DECODR软件支持的Sanger测序突变类型分析。

文库构建与验证

通过整合序列相似性和表达谱数据，研究人员首先鉴定出1833个可被单一sgRNA靶向的基因集（涉及3910个基因）。利用定制化寡核苷酸池和分组PCR扩增策略，成功构建了10个CRISPR-Cas9质粒文库。NGS（下一代测序）分析显示文库覆盖率达98.1%-100%，偏斜比均小于2.1，符合高质量文库标准（偏斜比<10，覆盖率>99.5%）。

高阶突变体创制与遗传分析

种子特异性文库（29个sgRNA靶向66个基因）转化后，91%的T₀代植株显示编辑事件，其中约75%实现了所有靶基因的同步敲除。突变类型分析表明，纯合突变占比最高（33%），并检测到高达303bp的大片段缺失。T₁代遗传分析证实突变可稳定遗传，且部分T₀代未编辑位点在T₁代出现新突变，提示 CRISPR-Cas9 持续活性。

籽粒发育相关基因功能发现

95% of the reads show a single type of indels, Heterozygous-reads which show both wild-type and single indel, Biallelic- reads with only two types of indels, Chimeric- reads with more than two types of indels. D. Distribution of different sizes of indels in the T0 edited population.'>

对12个sgRNA对应的54个等位基因的籽粒表型分析发现：靶向Serpin结构域蛋白基因（LOC_Os11g12410/LOC_Os11g12420）的sgRNA#13所有等位基因均显著增加粒长；而靶向Agenet结构域蛋白基因（LOC_Os09g24290/LOC_Os10g26430）的sgRNA#11突变体呈现复杂表型。通过比较单敲除与双敲除植株，发现LOC_Os10g26430单敲除导致穗粒数和产量显著降低，而LOC_Os09g24290单敲除与双敲除均提高粒重但降低产量，表明LOC_Os09g24290在调控粒重方面位于LOC_Os10g26430下游，二者存在上位性互作。

本研究首次在水稻中实现了基于CRISPR-Cas9文库的高阶敲除突变体规模化创制，为解析冗余基因功能提供了新范式。虽然存在部分基因集靶向不全、转化品种基因组信息缺失等局限，但高达91%的编辑效率和稳定遗传的突变体群体充分验证了该策略的可行性。发现的Agenet结构域蛋白基因上位性互作机制，为水稻籽粒性状遗传调控网络提供了新见解。该技术体系有望拓展至其他作物，加速植物功能基因组学研究和育种进程。