FAME-CRISPR：通过HDAC抑制和工程化病毒样颗粒递送提升CRISPR-Cas9基因组编辑效率

本研究针对CRISPR基因组编辑在特定细胞类型中效率不足、依赖单细胞克隆等瓶颈问题，开发了FAME-CRISPR新方法。研究人员通过优化pan-HDAC抑制剂处理增强染色质可及性，结合工程化病毒样颗粒(eVLPs)递送系统，在DSB介导的CRISPR、碱基编辑(ABE/CBE)中实现编辑效率提升4-5倍，显著缩短工作流程，为原代细胞基因编辑提供了高效解决方案。

　　

基因组编辑技术CRISPR-Cas9的出现为生物医学研究带来了革命性变革，但在实际应用中仍面临诸多挑战。特别是在原代细胞等难以转染的细胞类型中，编辑效率往往不尽如人意，研究人员不得不依赖耗时耗力的单细胞克隆步骤来获得纯合的编辑群体。对于具有有限复制寿命的原代细胞而言，这一限制尤为突出，严重制约了基因编辑技术在疾病模型构建和基因治疗中的应用。

更为棘手的是，即使采用当前最先进的递送系统，如工程化病毒样颗粒(eVLPs)，虽然能够降低细胞应激并减少脱靶效应，但其编辑效率仍低于组成型表达系统。碱基编辑技术虽能实现精确的单核苷酸改变，避免双链断裂(DSBs)，但中等编辑效率往往要求延长工作流程，仍需单细胞分离。这些技术瓶颈促使研究人员寻求新的策略来突破效率限制。

在这项发表于《Cell Reports Methods》的研究中，Djamshidi等人开发了一种名为FAME-CRISPR（快速、准确、更高效的CRISPR）的新方法，通过联合使用pan-组蛋白去乙酰化酶抑制剂(pan-HDACis)和eVLP递送系统，显著提高了CRISPR-Cas9基因组编辑的效率。

研究团队采用的关键技术方法包括：使用六种不同来源的永生化细胞系（HeLa、HepG2、U2OS、A549、MDA-MB-231和Cal33）和原代细胞（Hs68人真皮成纤维细胞），通过慢病毒载体构建稳定表达EGFP报告基因的细胞系；优化pan-HDAC抑制剂（panobinostat和belinostat）的处理浓度和时间，以Western blot检测组蛋白H3乙酰化(H3-Ac)水平；利用工程化病毒样颗粒(eVLPs)递送Cas9蛋白和碱基编辑器；采用染色质免疫沉淀定量PCR(ChIP-qPCR)评估染色质可及性；通过数字PCR(dPCR)分析大片段缺失情况；使用Sanger测序和MultiEditR、Synthego ICE等生物信息学工具量化编辑效率。

确定最佳HDAC抑制和Cas9水平

研究人员首先构建了含有EGFP-T2A-blasticidin抗性(BlastR)基因和独立嘌呤霉素抗性(PuroR)基因的慢病毒报告系统，用于简化编辑效率的量化。通过测定不同浓度pan-HDACis处理24、48和72小时后的细胞活性和H3-Ac水平，发现panobinostat在24小时内能快速诱导H3-Ac，且在大多数细胞系中表现出比belinostat更强的组蛋白乙酰化效果。同时，通过时间进程实验确定了eVLP递送Cas9蛋白的最佳时间点为转导后24小时。

Panobinostat和belinostat改善DSB介导的CRISPR

研究人员协调了eVLP转导和pan-HDACis处理的时间，使最大组蛋白乙酰化和Cas9递送同时发生。针对EGFP序列中三个不同位点的编辑实验表明，panobinostat将sgRNA#1、#2和#3的编辑效率平均提高了约5.3倍、5.72倍和4.1倍，而belinostat则分别提高了约4倍、5.0倍和3.5倍。累计135个编辑事件的分析显示，panobinostat平均提高编辑效率4.91倍，belinostat平均提高4.01倍。

pan-HDACis处理细胞的恢复时间

细胞活性实验显示，pan-HDACis处理使细胞代谢活性暂时降至60%-70%，但所有细胞系（除MDA-MB-231外）在120小时内均恢复至处理前水平。Western blot检测caspase-3剪切情况表明，pan-HDACis处理确实会诱导部分细胞凋亡，但细胞能够从处理中恢复。γH2AX焦点形成实验显示，除HeLa和MDA-MB-231细胞外，其他细胞系在实验条件下未观察到一致的基因组范围内γH2AX焦点形成趋势。

Pan-HDACis panobinostat和belinostat改善腺嘌呤碱基编辑

研究团队进一步测试了pan-HDACis对腺嘌呤碱基编辑器(ABE)的效率提升效果。使用Xmas-Tree ABE报告系统，比较panobinostat与已报道的化合物（SB505124、PCI-24781和VPA）的效果。结果表明，panobinostat在Hs68、HeLa、MCF10A和Jurkat细胞系中均表现最优，平均编辑效率达到75%，显著高于其他化合物（40%-44%）。Jurkat细胞的编辑效率最高，panobinostat处理达到93%，而DMSO对照组仅为32%。

Panobinostat和belinostat改善胞嘧啶碱基编辑

在胞嘧啶碱基编辑(CBE)方面，研究人员使用YEE-BE4MAX编辑器（将编辑窗口缩小至C5-C6位置）测试了pan-HDACis的效果。在原代Hs68成纤维细胞中，经过两轮pan-HDACis补充的eVLP转导，三个不同sgRNA的编辑效率分别达到74%（sgRNA1和2）和83%（sgRNA3）。panobinostat和belinostat分别使编辑效率提高了3.8倍和3倍。重要的是，在C5-C6位点附近-15至+15 bp范围内的胞嘧啶未观察到明显的旁观者编辑，表明高编辑精度得以保持。

FAME-CRISPR方法通过联合使用pan-HDACis和eVLP递送系统，显著提高了CRISPR-Cas9基因组编辑的效率。该方法在DSB介导的CRISPR、腺嘌呤碱基编辑(ABE)和胞嘧啶碱基编辑(CBE)中均表现出色，将编辑效率提高了3-5倍。特别值得关注的是，该方法在原代细胞中的应用成功，为具有有限复制寿命的细胞类型进行高效基因编辑提供了可行方案。

研究的创新之处在于优化了pan-HDACis的处理条件，使其在诱导染色质可及性增加的同时，最大程度地减少对细胞活性的影响。通过将HDAC抑制与瞬时eVLP递送相结合，研究人员能够在2-3个细胞平均群体倍增(MPDs)内获得显著编辑的群体，大大缩短了工作流程，降低了对单细胞分离的依赖。

尽管该方法在多种细胞类型中有效，但仍存在一定局限性。例如，sgRNA的细胞系特异性问题仍未完全解决，pan-HDACis处理无法克服某些sgRNA在特定细胞系中完全无效的情况。此外，虽然数字PCR分析未检测到大量缺失的显著增加，但评估极大缺失和染色体重排的能力仍有限。未来研究需要在全基因组范围内进一步评估潜在的脱靶效应和非预期编辑。

总体而言，FAME-CRISPR为基因组编辑领域提供了一种高效、快速的方法，特别适用于原代细胞和需要大规模生成多个编辑模型的场景。该方法显著降低了工作负担和所需材料，同时最大化编辑效率并保持群体异质性，为功能基因组学研究和基因治疗应用提供了有力工具。