研究综述：顶刊怎么用CST CAR Linker抗体？

随着用于治疗实体肿瘤、血液系统恶性肿瘤和自身免疫性疾病的嵌合抗原受体 (CAR) 细胞疗法不断发展，准确检测和监控CAR工程化细胞对于实验验证至关重要。然而，对于检测单链可变片段(scFv) CAR的表达，开发和验证基于靶抗原或抗独特型抗体的检测试剂是一个漫长的过程。并且，这种方法的适用性有限，仅能用于检测针对特定表面抗原或特定scFv的CAR。

Cell signaling Technology (CST) 开发的CAR Linker重组单克隆抗体是一种强大的工具，能够准确识别和验证工程化CAR的表达，而不受限于其靶抗原的特性。由于大多数基于scFv的CAR含有G4S或Whitlow/218接头的重复序列，因此可以使用高特异性的抗 G4S Linker抗体和抗Whitlow/218 Linker抗体来监测任何基于scFv的CAR的表面表达。

图示：CAR Linker重组单克隆抗体与基于scFv的CAR在可变重链和可变轻链结构域之间的接头序列（G4S或Whitlow/218）结合

科学家如何在研究中使用CST CAR Linker抗体？在本次研究综述中，我们重点介绍最近发表的利用CST CAR Linker抗体在各种实验环境中检测、分析、定量和纯化CAR工程化细胞的论文。我们会用下面的CAR表征流程框架来描述研究作者的工作，以便您更清晰地了解其中涉及的步骤和方法：

CST CAR Linker抗体在上市不到两年的时间里，已经应用在从筛选CAR阳性细胞到标记CAR工程化细胞进行纯化或激活等诸多方面，CST也在不断开发更优质的试剂来提高检测、纯化和表征CAR表达细胞的能力。

这些公开发表的研究论文为应用CST CAR Linker 抗体提供了难得的实践经验和方法论，让我们来看看基于CAR Linker抗体的表征解决方法：

1、针对胶质瘤的EphA3靶向CAR-T细胞可产生治疗性记忆T细胞反应

Lertsumitkul 等(JITC 2024) | DOI:10.1136/jitc-2024-009486

本研究构建并评估了针对Ephrin A型受体3(EphA3)靶点的第二代CAR-T细胞疗法，作者发现这个靶点在高级别胶质瘤(包括胶质母细胞瘤和弥漫性中线胶质瘤)中普遍表达。EphA3靶向细胞疗法在体外和体内模型实验表现出强大的癌细胞杀伤能力，并在小鼠模型中清除了肿瘤组织。

应用方法

定量：使用G4S Linker (E7O2V) Rabbit mAb来确认EphA3靶向CAR-T细胞的存在和扩增，以确定T细胞转导效率。

2、接头特异性单克隆抗体为检测基于scFv的CAR-NK细胞提供了一种简单可靠的方法

Schindler 等(Molecular Therapy 2024)  | DOI: 10.1016/j.omtm.2024.101328

CAR自然杀伤(NK)细胞正在临床试验中被研究，以探索其相比CAR-T细胞疗法的潜在优势，包括将其转化为异体细胞疗法。这项研究评估了通用且灵敏的基于CAR Linker抗体的CAR-NK细胞检测应用，并与其他常用方法进行了比较。研究结果表明，CAR Linker抗体在检测体外、全血中和患者来源的肿瘤球体样品中的不同CAR-NK细胞时，都表现出高度的特异性和灵敏度，为基于scFv的CAR检测提供了一种有效且近乎通用的替代方案。此外，作者证明CAR Linker特异性抗体也可用于CAR-NK细胞的功能测试和富集。

应用方法

检测：为了确认CAR表达，使用Whitlow/218 Linker(E3U7Q)Rabbit mAb和G4S Linker(E7O2V)Rabbit mAb进行基于流式细胞术的各种CAR构建体检测。 

分析：将Whitlow/218 Linker(E3U7Q)Rabbit mAb和G4S Linker(E7O2V)Rabbit mAb应用于激活检测，以确认其选择性激活CAR-NK细胞的能力。(探索CST的T细胞激活检测)

纯化：使用Whitlow/218 Linker(E3U7Q)Rabbit mAb和G4S Linker(E7O2V)Rabbit mAb进行磁分离富集CAR-NK细胞。作者证明，CAR-NK细胞在纯化后不会被激活，其活力也不会受到损害。(探索CST的磁珠CAR富集检测)

3、使用G4S Linker抗体进行基于磁珠的CAR-T细胞纯化

Harrer 等(JIM 2024) | DOI: 10.1016/j.jim.2024.113667

本研究介绍了一种基于G4S Linker 抗体的CAR-T细胞磁分离纯化新方法。该方法在将CAR-T细胞富集到高纯度的同时，不会影响其活力或功能。该方法分别在CEA靶向和Her2靶向的CAR-T细胞以及双特异性串联CAR上进行了测试。

应用方法

纯化：使用G4S Linker(E7O2V)Rabbit mAb标记CAR-T细胞后进行细胞磁分选(MACS)，结果证明此方法可以高效纯化CAR-T细胞且不损害细胞活力。(探索CST的磁珠CAR富集检测)

4、合成免疫检查点接合剂保护HLA缺陷型诱导多能干细胞(iPSC)及其衍生物免受天然免疫细胞的细胞毒性作用

Gravina 等(Cell Press 2023) | DOI: 10.1016/j.stem.2023.10.003

该研究的作者设计并测试了一类新型合成细胞表面分子(接合剂)，这些分子能够激活免疫细胞中的免疫检查点并抑制细胞毒性。具体来说，作者设计并测试了针对免疫检查点SIRPa、TIM3和LILRB1的接合剂，以防止来自NK细胞和巨噬细胞的细胞毒性免疫攻击。该方法旨在帮助保护异体免疫或再生细胞疗法免受排异反应，并提高其功效。

应用方法

检测：G4S Linker(E7O2V)Rabbit mAb(Alexa Fluor® 647 Conjugate)#69782被用在流式细胞术中对接合剂的表面表达进行检测和定量，以研究工程化接合剂在与其靶标分子结合之前和之后的表达动力学。

检测：在流式细胞分析中，使用生物素化的抗G4S接头F(ab’)2片段来评估通过表达合成转基因(SIRPa-E和CD64t)的B2M敲除iPSC实现免疫逃逸的可行性。

5、CAR Linker单抗在双特异性抗体(BiTEs/bsAbs)与CAR-T细胞联合治疗监测中的应用评估

Grahnert et al. (Biomedicines 2024) | DOI:10.3390/biomedicines12081641

本研究探讨了CAR Linker抗体在双特异性抗体(bsAbs)或BiTE药物治疗患者中对CAR-T细胞疗法的监测作用。当CAR-T细胞与双抗/BiTE药物靶向相同抗原时，传统基于抗原的CAR检测方法会产生假阳性结果。本研究通过分析包含所有已获批临床使用的BCMA靶向和CD19靶向CAR-T细胞产品的临床样本，证实CAR Linker单抗能提供不受BiTE或双抗治疗影响的高特异性检测方法，但其检测灵敏度在不同临床应用的CAR-T细胞疗法中存在差异。

应用方法

检测：CST CAR Linker抗体在检测经Ide-cel、Tisa-cel、Axi-cel、Brexu-cel和Liso-cel治疗的患者血液样本中的CAR-T细胞时，表现出高灵敏度和特异性。该方法为区分CAR-T细胞染色与基于抗原检测方法中免疫细胞接合剂引起的背景染色提供了可靠方案。然而，含有G4S-CAR接头的Cilta-cel无法被检测到。

6、CD8α结构域增强GUCY2C CAR-T细胞疗效

Baybutt 等(Cancer Biology & Therapy 2024) | DOI: 10.1080/15384047.2024.2398801

这项研究考察了工程化CAR-T细胞中的铰链区和跨膜结构域，旨在探究不同分子构建对实体瘤免疫疗法中CAR-T细胞功能的影响。具体而言，研究人员在靶向结直肠癌GUCY2C的CAR设计中，对比了源自CD8ɑ或CD28分子的铰链区和跨膜结构域的效果。研究人员发现，虽然这些结构域未引起抗原非依赖性条件等显著差异(如CAR表达水平、T细胞分化状态和耗竭表型)，但含CD8ɑ结构域的CAR显示出更强的靶标(GUCY2C)亲和力。

应用方法

检测：G4S Linker(E7O2V)Rabbit mAb(PE Conjugate)#38907被用于流式细胞术检测和定量CAR的表面表达。对比使用Protein L检测到对表面表达，两种方法获得的数据具有一致性。

检测：G4S Linker(E7O2V)Rabbit mAb(Alexa Fluor® 488 Conjugate)#50515被用于以下两种流式细胞术实验，以标记和鉴定CAR阳性T细胞。

欢迎联系CST授权一级代理商基因有限公司，或者扫描以下技术支持二维码，探索更完整的CAR工程细胞表征解决方案组合。