《Horticulturae》：High-Copy SINE Transposons Facilitate Broad Ecological Adaptation in White Clover (Trifolium repens)
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本综述系统探讨了葡萄（Vitis spp.）遗传转化（基因传递与植株再生）面临的效率低、周期长、基因型依赖性强等挑战。文章重点评述了农杆菌（Agrobacterium）介导的转化、体细胞胚胎发生（SE）与器官发生两条再生途径的优化策略，并提出通过开发高效标记基因（如RUBY）、利用发育调节因子（DRs，如GRF、BBM、WOX）以及建立新型转化系统（如DNA-free编辑）来突破现有瓶颈，为葡萄精准育种提供了重要理论和方法学指导。
葡萄遗传转化的挑战与未来策略
传统葡萄育种方法周期长、效率低，难以满足快速发展的葡萄产业需求。虽然遗传转化和基因组编辑技术为品种改良带来了巨大潜力，但其应用仍受限于转化效率、速度以及严重的基因型依赖性。这篇综述系统梳理了影响葡萄遗传转化的关键环节——基因传递和植株再生，并展望了未来的突破方向。
目标基因传递
将外源基因成功导入受体材料是遗传转化的第一步。方法主要分为直接基因转移和间接基因转移两大类。
直接基因转移，如基因枪法、花粉管通道法和聚乙二醇（PEG）介导的转化，因其转化效率低、嵌合体率高、再生困难等局限性，在葡萄转化中的应用非常有限。例如，基因枪法虽能递送多种生物材料，但常导致多拷贝随机插入，转基因表达不可预测。花粉管通道法操作简单，但葡萄花期短且易闭花授粉，其适用性有待更多验证。PEG介导的瞬时转化体系虽已建立，但直到2022年才通过该途径成功获得完整的基因编辑植株，其应用仍需进一步发展。
相比之下，间接基因转移，尤其是农杆菌（Agrobacterium）介导的转化，因其高效率、操作简便、遗传稳定等优点，成为葡萄遗传转化的主导方法。其效率受多种因素影响，包括受体材料、农杆菌菌株（如EHA105、GV3101）、感染液浓度（OD600通常为0.2–1.0）、感染时间（7–20分钟）、共培养时间（通常48或72小时）、乙酰丁香酮（AS）浓度（通常100或200 μM）以及选择性剂（如卡那霉素Kan、潮霉素Hyg）的种类和浓度。优化这些参数对于建立高效转化体系至关重要，但需注意，某一基因型或外植体的最佳条件未必适用于其他情况。
葡萄的再生
建立高效的再生体系是遗传转化成功的关键。葡萄再生主要通过两条途径：器官发生和体细胞胚胎发生。
器官发生途径指外植体（如茎尖分生组织、叶片、叶柄）直接或通过愈伤组织间接形成不定芽，再发育成完整植株。其优点是周期较短，例如在某些品种中，11周左右即可获得发育良好的芽。然而，该途径极易产生嵌合体，且基因型依赖性更强，大大限制了其广泛应用。
体细胞胚胎发生是目前葡萄遗传转化体系的首选再生途径。花器官等外植体可诱导产生体细胞胚胎（SE），进而发育成植株。虽然花器官的体细胞胚胎诱导率很高（如‘Shine Muscat’可达44.9%），但从外植体到成苗的整个过程耗时约12个月，且诱导效率低。通过将SE反复脱分化为胚性愈伤组织（EC）再重新分化为新SE的循环策略，可以实现大量材料的长期保存和用于转化，但长期继代培养会伴随体细胞无性系变异风险增加。
两种再生途径在程序框架和时间周期上存在显著差异。体细胞胚胎发生需要经历明确的胚胎发育阶段，周期长，培养基更换频繁；而器官发生周期短，培养基相对简单。但由于体细胞胚胎起源于单细胞，器官再生源于组织团块，器官发生更易形成嵌合体。体细胞胚胎发生途径能够保存大量体细胞胚胎，避免重复的初始诱导，是其一大优势。
影响再生的因素众多，包括外植体选择、激素方案、有机添加剂以及畸形苗的发生等。再生能力是葡萄固有的基因型性状，导致遗传转化研究高度集中在少数几个易再生品种上。生长素和细胞分裂素在调控再生中起核心作用，不同种类和浓度的激素组合效果差异显著。此外，培养基成分，特别是外源激素，是影响正常体细胞胚胎发育的关键因素。
葡萄遗传转化的未来
为了克服现有挑战，未来研究可从以下几个方面着手：
标记基因的开发与应用：标记基因在转化中用于筛选阳性个体和跟踪基因表达。除常用的GUS、GFP及其变体外，新型报告基因如RUBY，能产生肉眼可见的红色色素，大大简化了检测过程。利用葡萄内源基因（如VvMybA1）诱导花青素积累产生颜色区分，因其未引入外源遗传物质，是开发葡萄优化报告基因的有前景候选者。
发育调节因子（DRs）的探索与利用：研究表明，特定基因能主动促进植物再生。例如，生长调节因子（GRFs）与GIF共因子形成的转录复合物、BABY BOOM（BBM）、WUSCHEL（WUS）相关同源框（WOX）基因等，在多种作物中被证实可提高再生效率，甚至克服基因型限制。尽管葡萄基因组中含有这些基因的同源物，且异源表达VvGRF-GIF嵌合体等在柑橘、草莓、烟草中成功提升了再生效率，VvBBM过表达在‘Cabernet Sauvignon’未成熟合子胚中也显示出促进萌发和植株发育的潜力，但利用发育调节因子（无论是同源还是异源）促进葡萄再生的实际应用案例仍然非常缺乏。组合表达DRs、使用组织特异性或诱导型启动子以及“利他转化”策略有助于减轻单一基因方法带来的多效性效应、发育异常等弊端。
新型遗传转化系统的建立：瞬时转化系统（如农杆菌介导的叶片瞬时转化、PEG介导的原生质体瞬时表达）为基因功能验证提供了高效、快速的平台。DNA-free编辑是基因组编辑的核心目标，通过PEG介导递送核糖核蛋白（RNP）复合体进入原生质体已在葡萄中实现。纳米材料（如碳纳米管CNT）介导的递送技术也为DNA-free编辑开辟了新途径。此外，借鉴其他物种的成功经验，探索基于根再生、原位（in planta）转化等新型策略（如柑橘中的IPGEC系统），以及利用未成熟合子胚建立无需组织培养的快速转化体系，均为葡萄遗传转化的创新提供了宝贵思路。
结论
遗传转化是葡萄基因功能验证、机理解析和品种改良的强大工具。然而，当前转化体系效率低、周期长，且主要局限于少数品种。发育调节因子有望提高再生效率、克服基因型依赖性，但其在葡萄中的应用亟待加强。新型转化系统（如IPGEC、Fast-TrACC、CDB系统）和瞬时RNP递送系统的不断发展，为绕过繁琐的组织培养程序、建立更简单高效的葡萄转化平台提供了参考。整合单细胞或多组学数据解析葡萄再生机制，将为靶向再生策略的优化提供信息。通过多方面的协同创新，有望最终建立起稳定、高效、适用于更广泛葡萄品种的遗传转化体系。
