在Limosilactobacillus reuteri AR673菌株中建立CRISPR干扰（CRISPRi）系统

《Food Bioscience》：Establishment of a CRISPR interference (CRISPRi) system in Limosilactobacillus reuteri AR673

本研究以乳杆菌Limosilactobacillus reuteri AR673为对象，构建了首个双质粒CRISPRi系统，通过设计靶向upp和ldh基因不同位点的单向sgRNA，证实单基因抑制效率最高达91%，双sgRNA组合抑制效率提升19%，同时实现upp和ldh基因的协同抑制（效率分别为80%和60%）。该系统具有低毒、可逆、多基因调控及单基因多位点抑制功能，为乳杆菌代谢工程和功能基因组学研究提供了新工具。

　　

宋欣|张晓丽|夏永军|王广强|艾连忠

上海科技大学健康科学与工程学院，上海200093，中国

摘要

本研究以Limosilactobacillus reuteri（L. reuteri）AR673为研究对象，构建了一种双质粒CRISPR干扰（CRISPRi）系统。以upp和ldh基因为靶标，设计了针对不同位点的单导向RNA（sgRNAs）。结果表明，所有针对不同位点的sgRNAs均能显著抑制目标基因的转录水平，最高抑制效率可达91%。此外，对于同一目标基因，双sgRNAs的组合表现出更高的抑制效率，表明多个sgRNAs的协同效应可以有效增强对难以抑制的基因的调控作用。通过使用upp和ldh基因作为靶标，验证了该系统对多个基因的同时抑制效果。结果显示，ldh基因的抑制效率为80%，upp基因的抑制效率为60%。总之，构建了一种适用于L. reuteri的CRISPRi系统，能够实现对单个基因、多个基因以及单个基因的多位点抑制，从而为后续的L. reuteri基因改造提供了遗传操作工具。

引言

乳酸菌（LAB）是食品发酵、益生菌和合成生物学应用中的重要底盘生物。精确调控基因表达仍是代谢工程和功能研究的核心挑战。近年来，高效且精确的基因编辑技术迅速发展，特别是CRISPR–Cas系统在乳酸菌中的应用越来越受到关注。该系统最初被鉴定为一种细菌适应性免疫机制，通过导向RNA和Cas蛋白的协同作用介导特异性目标DNA切割和编辑（Barrangou等人，2007；Pourcel等人，2005）。CRISPR–Cas技术不仅在基因功能分析、菌株改良和疾病治疗方面展现出巨大潜力，还为乳酸菌的遗传操作提供了有力平台（Esvelt等人，2013）。2014年，Oh等人首次将CRISPR–Cas9与重组技术结合，实现了Limosilactobacillus reuteri染色体的密码子饱和突变。然而，当删除大于1 kb的DNA片段时，效率显著下降，表明需要在重组能力较低的宿主中进行进一步优化。Song等人（2017）开发了pLCNICK系统，利用Cas9^D10A核酸酶对Lacticaseibacillus casei进行基因编辑，通过一步转化即可高效实现单基因删除或插入，将编辑周期缩短至9天。基于CRISPR的平台已在多种乳酸菌中建立，包括Lactobacillus plantarum、Lactobacillus brevis、Lactococcus lactis（Song等人，2021）、Streptococcus thermophilus和Bifidobacterium spp。Huang等人（2019）使用双质粒Cas9系统和RecE/T重组技术在L. plantarum WCSF1和L. brevis ATCC 367中实现了单基因敲除和插入，并将丙酮酸脱羧酶整合到L. plantarum中以增强乙醇产量。Selle等人（2015）利用S. thermophilus的内源性II-A型CRISPR–Cas9系统切除非必需基因组岛，驱动群体水平的大规模基因组进化并影响基因组稳态和重塑。Li等人（2023）在Bifidobacterium AR668中建立了首个CRISPR–Cas9基因编辑系统，实现了三个胞外多糖合成基因的同时删除，生成了低粘度表型。发酵试验显示细胞沉降率提高了三倍，鉴定出一种适用于高密度培养的底盘菌株。

尽管CRISPR–Cas9技术在乳酸菌中实现了靶向突变，但由于宿主重组效率低、大片段删除困难以及不可逆切割导致的细胞毒性限制了复杂代谢途径的优化（Mu等人，2022）。在CRISPR干扰（CRISPRi）技术中，失活的Cas蛋白结合目标基因的启动子区域或转录起始位点以抑制转录。这种可逆技术能够实现多基因协同调控，且对细胞的损伤较小，非常适合解决上述限制。CRISPRi已成功应用于多种乳酸菌，成为研究基因功能、调控代谢途径和开发新型益生菌菌株的强大工具（Ghavami等人，2021）。Berlec等人开发了一种单质粒诱导的CRISPR–Cas/CRISPRi系统，通过靶向upp转录起始位点显著降低了uppmRNA的表达，从而避免了5-氟尿嘧啶的毒性（Berlec等人，2018）。Xiong等人（2023）在L. lactis NZ9000中构建了双质粒CRISPRi系统，其中由诱导型启动子驱动的dCas9表达和目标基因特异性单导向RNA（sgRNA）实现了单个或多个基因的沉默，基因表达降低了高达99%。Myrbr?ten等人（2019）使用CRISPRi技术在L. plantarum中下调基因表达，揭示了关键细胞周期基因的功能，并证明该系统适用于快速筛选必需和非必需基因表型。尽管Oh等人早在2014年就将CRISPR技术应用于L. reuteri，但目前仍缺乏适用于该菌株的可行CRISPRi平台，严重限制了其转录组的精确调控。

我们首次在L. reuteri AR673中实现了CRISPRi双质粒系统的应用。通过RT-qPCR量化了目标基因的表达，并系统评估了单个基因、单个基因内的多个位点以及多个基因的协同抑制效果。单个基因的转录被抑制了57%–91%。双sgRNA组合的抑制效率比单sgRNA高19%。RT-qPCR确认了upp和ldh的同时抑制效果。这项工作为L. reuteri提供了一种强大且多功能的基因表达调控工具，为功能基因组学、代谢工程和下一代益生菌开发奠定了坚实基础。

章节片段

菌株和质粒

大肠杆菌 TOP10被用作克隆宿主，并在37°C的LB琼脂上培养。E. coli转化体通过红霉素（200 μg mL^-1）和氯霉素（12.5 μg mL^-1）进行筛选。L. reuteri AR673保存在上海科技大学健康科学与工程学院的菌株库中。L. reuteri AR673在37°C的MRS培养基中厌氧培养；必要时添加红霉素（5 mg L^-1）和氯霉素（5 mg L^-1。

在L. reuteri AR673中构建和验证双质粒CRISPRi系统

为了构建L. reuteri的基因抑制工具包，我们构建了一个双质粒CRISPRi系统，包括可诱导的dCas9表达质粒pZXL-dCas9和sgRNA表达质粒pZXL-uppC和pZXL-pyrR（图1）。

监测重组菌株的OD₆₀₀值36小时，以评估CRISPRi组分对L. reuteri AR673生长的影响（图2）。仅表达dCas9、仅表达sgRNA或同时表达两者的菌株的生长曲线与空载体对照组无显著差异，表明

讨论

我们报道了首个在L. reuteri中的模块化双质粒CRISPRi系统。与某些革兰氏阳性细菌中dCas9毒性的报道相反，dCas9和sgRNA的共同表达并未影响宿主生长（图7）。pNZ44/pIB184载体在乳酸菌中的稳定复制可能减少了代谢负担，这是这种耐受性的原因（Liu等人，2017）。我们的系统实现了对upp和pyrR超过68%的抑制，证明了其在L. reuteri中的跨基因效果，提供了一个安全可靠的

结论

我们首次在L. reuteri AR673中实现了高效、低毒性的双质粒CRISPRi系统。该系统使用可诱导的启动子动态调控dCas9的表达，并通过模块化的sgRNA盒实现精确的转录抑制，同时保持宿主生长（图7）。该系统没有DNA切割毒性，支持可逆调控，并允许多重靶向，从而超越了传统的CRISPR-Cas9编辑方法。

CRediT作者贡献声明

宋欣：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，验证，方法学，研究，形式分析，概念化。夏永军：撰写 – 审稿与编辑。张晓丽：撰写 – 原始草稿，方法学，形式分析。艾连忠：撰写 – 审稿与编辑，项目管理，数据管理，概念化。王广强：监督，项目管理，研究

未引用的参考文献

Cui和Bikard，2016；Frusteri Chiacchiera等人，2025；Ghavami和Pandi，2021；Oh和van Pijkeren，2014；Xiong等人，2020。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。

数据可用性

本研究生成的原始数据可向通讯作者索取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（批准号：U22A20540、32472316）、国家杰出青年科学基金（批准号：32025029）、上海市教育委员会科研创新项目（批准号：2101070007800120）以及上海工程研究中心食品微生物学项目（批准号：19DZ2281100）的支持。