《ACS Omega》：Myogenic Potential in Labeo rohita Dorsal Muscle Cell Line and Development of CRISPR-Cas9 Construct for Myostatin Gene
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本研究成功建立了鲁氏背肌细胞系（LRDM），并通过表达PAX7和MYOD等关键标记物证实其在不同传代次数下的成肌潜能。研究进一步利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术，针对负向调控骨骼肌生长的肌抑素（MSTN）基因，成功构建了基因敲除载体。该工作为研究鱼类肌肉发育的分子机制提供了有价值的细胞模型，并为通过基因编辑技术培育肌肉生长增强型鱼类、推动细胞水产养殖（Cellular Aquaculture）和培养鱼肉（Cultivated Fish Meat）生产的技术进步奠定了坚实基础。
引言
Labeo rohita，俗称罗胡，是一种属于鲤科的淡水鱼，在东南亚国家备受青睐。作为印度主要鲤鱼类之一，其对全球水产养殖产量的贡献举足轻重。肌肉质量约占鱼类总体重的50%至70%，因此研究肌肉生长的机制，特别是通过敲除肌抑素基因来促进肌肉生长，具有重要的经济意义。肌抑素是转化生长因子-β超家族成员，是骨骼肌生长的负调控因子。CRISPR-Cas9技术作为一种强大的基因组编辑工具，已广泛应用于各种生物体，为精准靶向和修饰特定基因（如肌抑素基因）提供了可能。本研究旨在探究L. rohita背肌细胞系在不同传代次数下成肌调控因子MYOD和PAX7的表达情况，并设计针对肌抑素基因的CRISPR-Cas9敲除构建体。
材料与方法
伦理声明
所有实验方案均获得印度孟买ICAR-中央渔业教育研究所鱼类遗传与生物技术部门的机构动物伦理委员会和学术委员会的批准。
实验鱼与细胞培养
健康的L. rohita标本取自ICAR-CIFE水产养殖部门。采用组织块法从其背部肌肉组织建立细胞系。将组织切成1 mm3的小块作为外植体，使用添加了15%胎牛血清的L-15培养基进行原代培养。细胞在28°C下培养，当融合度达到85-90%时，使用0.25%的胰蛋白酶溶液进行消化传代。建立的细胞系被命名为LRDM，并成功传代至35代。从第10代起，培养基中的FBS浓度逐渐降至5%。
物种认证
通过提取肌肉组织和LRDM细胞系的基因组DNA，利用通用引物扩增线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因，并进行测序和BLAST比对，确认了细胞系来源于L. rohita。
铺板效率与细胞倍增时间
在第8代LRDM细胞中，通过以不同细胞密度接种并计数形成的集落数来计算铺板效率。结果显示，接种1000个细胞的组别具有最高的铺板效率。细胞倍增时间通过特定公式计算。
冷冻保存与复苏
LRDM细胞在第10代和第25代使用含10%二甲基亚砜的冷冻保护液进行冷冻保存，储存于-80°C。复苏后评估复苏效率，第10代细胞的复苏效率显著高于第25代。
成肌能力确认
通过免疫细胞化学技术检测第10、20和30代LRDM细胞中PAX7和MYOD蛋白的表达。PAX7使用小鼠单克隆抗体，MYOD使用兔多克隆抗体，并分别用Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG和Alexa Fluor 568标记的山羊抗兔IgG作为二抗，细胞核用DAPI复染。通过荧光显微镜观察并利用ImageJ软件量化平均荧光强度。
CRISPR-Cas9构建体开发
利用在线工具CRISPRscan设计靶向L. rohita肌抑素基因外显子1的向导RNA序列，并使用CasOFFinder软件预测脱靶效应。将设计的寡核苷酸退火后，连接到T7cas9sgRNA2载体中。通过转化、筛选阳性克隆、质粒提取和桑格测序验证插入的正确性。使用BamHI限制性内切酶线性化gRNA质粒，并通过MEGAshortscript T7试剂盒进行体外转录和纯化。同时，使用XbaI限制性内切酶线性化pT3TS-nls-zCas9-nls质粒，并通过mMESSAGE mMACHINE T3试剂盒合成Cas9 mRNA。通过纳米微量分光光度计检测转录产物的浓度和纯度。
结果
肌肉细胞培养
外植体在制备后16-20小时内附着，4-5天后细胞开始从外植体周围辐射状生长。LRDM细胞系成功建立并维持至35代，虽然在5% FBS的培养基中生长速率较慢。
物种认证
COI基因PCR扩增获得预期大小的条带。测序结果显示，肌肉组织和LRDM细胞的序列与L. rohita的序列相似性达99.69%，证实了细胞系的物种来源。
细胞铺板效率
在第8代细胞中，铺板效率随着接种细胞数量的增加而升高，接种1000个细胞时效率最高。
冷冻保存与复苏效率
冷冻保存两个月后，第10代和第25代细胞均能成功复苏并附着，第10代细胞的复苏效率显著高于第25代。复苏后的细胞形态未发生改变。
成肌能力确认
免疫荧光染色显示，在所有检测的传代次数中，LRDM细胞均表达PAX7和MYOD。PAX7的表达在第10代最高，随后在第20代和第30代显著下降。相反，MYOD的表达在第10代较低，在第20代最高，而在第30代有所下降。这表明早期传代的细胞更具干细胞/祖细胞特性，而后期则向分化方向发展。
gRNA设计与克隆
成功设计了靶向MSTN基因的gRNA，未预测到脱靶效应。通过一步消化连接法将gRNA序列克隆到T7cas9sgRNA2载体中，桑格测序证实超过90%的克隆含有正确的插入序列。
体外转录与纯化
gRNA质粒和pT3TS-nls-zCas9-nls质粒经限制性内切酶消化后，分别在琼脂糖凝胶上显示出预期大小的线性化条带。体外转录成功获得了高浓度的gRNA和Cas9 mRNA。
讨论
本研究通过外植体法成功建立了L. rohita背肌细胞系LRDM，并证实其在不同传代次数下均具有成肌潜能。PAX7在早期传代高表达，表明细胞处于祖细胞状态；MYOD在中期传代表达升高，反映了细胞向肌细胞分化的进程。这种随传代变化的表达模式与其它鱼类细胞系的研究结果相似。细胞系表现出良好的铺板效率和冷冻复苏能力，适合长期储存和应用。此外，研究成功构建了靶向肌抑素基因的CRISPR-Cas9系统，为后续在LRDM细胞系中进行基因敲除、研究肌抑素功能以及开发肌肉生长增强的细胞模型奠定了基础。这项工作对理解鱼类肌肉发育机制以及推动细胞水产养殖和培养肉技术的发展具有重要意义。
结论
本研究成功建立了来自L. rohita的背肌细胞系LRDM，并证实其在不同传代次数下保持成肌能力。同时，成功开发了靶向肌抑素基因的CRISPR-Cas9敲除构建体。LRDM细胞系及其相关的基因编辑工具为研究肌肉发育的分子机制、进行基因功能研究以及开发新型水产养殖和培养肉技术提供了宝贵的资源。未来的工作将集中于验证肌抑素敲除对细胞肌肉表型的影响，进一步探索其在促进肌肉生长和应用方面的潜力。
