《Epigenetics Insights》：Transcriptome profiling of developing inflorescences reveals SiMADS1 as a key regulator of floral development in foxtail millet
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本研究通过分析谷子花序三个发育阶段的转录组图谱，并与幼苗期对比，揭示了SiMADS1在花器官发育中的核心作用。利用CRISPR/Cas9技术构建SiMADS1敲除株系（simads1），发现其花器官缺陷导致产量显著降低。结合RNA-seq与DAP-seq分析，鉴定出多个SiMADS1下游调控基因，为解析谷子花序发育分子机制提供了新遗传资源。
转录组图谱揭示谷子花序发育关键调控机制
材料与方法
研究选用谷子品种'晋谷21号'，于2023年5月至10月在山西晋中神丰试验田种植。分别采集双棱分生组织期（DR）、刚毛原基分生组织期（BP）和绿花药期（GrA）的花序组织样本，以两周龄幼苗叶片（SE）作为对照。每个组设置三个生物学重复，样本经液氮速冻后保存于-80°C超低温冰箱。利用体视显微镜（SZX16，奥林巴斯）拍摄不同发育阶段的花序组织形态。
为验证SiMADS1功能，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在Ci846背景中构建SiMADS1敲除株系。针对SiMADS1第一外显子设计两个间隔7bp的靶点，共获得25株阳性转基因植株，鉴定出6种编辑类型。选择simads1-4和simads1-7两个株系进行表型分析。
RNA-seq分析由OE生物技术有限公司完成。使用hisat2软件将Clean Reads与参考基因组进行比对，通过htseq-count软件统计每个样本中蛋白编码基因的比对读数。差异表达基因（DEGs）筛选标准为校正p值<0.05且倍数变化>2。根据FPKM值将基因表达水平分为六组：极高表达（FPKM>300）、高表达（FPKM 100-300）、中等表达（FPKM 30-100）、低表达（FPKM 10-30）、极低表达（FPKM<10）和无表达（FPKM<1）。
基因表达水平采用DESeq2软件基于FPKM值进行估计。通过负二项分布检验评估差异表达显著性，最终根据多重差异和显著性检验结果筛选差异蛋白编码基因。对DEGs进行基因本体（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析。使用OE Biotech云平台工具进行层次聚类、GO和KEGG通路富集分析。
DNA亲和纯化测序（DAP-seq）由博渊生物完成。使用Trimmomatic软件进行数据过滤，切除末端接头序列并保留最小长度20bp。过滤后的数据通过FastQC（版本0.11.5）进行质控，使用bwa软件将Clean Reads与参考基因组比对，预处理唯一比对读数用于后续分析。将基因组区域分为外显子、内含子、基因间区、启动子（转录起始位点上游2kb）和其他区域，取两个生物学重复共有的peak进行后续分析。
结果
全球基因表达谱分析
为探索花序发育的分子机制，研究基于谷子花序发育阶段进行了转录组分析。采集三个发育阶段的RNA-seq样本：双棱分生组织期（DR）、刚毛原基分生组织期（BP）和绿花药期（GrA），并与两周龄幼苗叶片（SE）转录组进行比较。12个样本（每组三个生物学重复）的Clean Reads范围在3871万至4683万之间，96.90%至98.04%的Clean Reads比对到参考基因组，91.26%至94.23%为唯一比对，表明读长质量和数量均满足基因表达定量分析要求。
主成分分析（PCA）显示每个样本组内的三个生物学重复紧密聚集，表明实验重复性高。RNA-seq结果检测到四个组共30,618个基因，其中GrA期基因数量最多。维恩图分析显示14,609个基因共表达，DR期特异性表达270个基因，BP期特异性表达172个基因，GrA期特异性表达1,088个基因。表达基因（定义为FPKM>1）共计22,587个。层次聚类分析对所有表达基因进行分组，GO富集分析和KEGG分析揭示了花序发育过程中的关键生物学过程和通路。
各时期高表达基因分析
相关性分析显示DR和BP期发育相似性较高。维恩图显示DR和BP期共表达17,466个基因，DR期特异性表达480个基因，BP期特异性表达901个基因。高表达基因分析发现，DR期26个转录因子（TFs）表达高于其他组，BP期1个TFs表达较高。KEGG和GO富集分析表明高表达基因富集于纤维素酶活性以及淀粉和蔗糖代谢途径。
与DR和BP期相比，GrA期发育过渡导致许多基因表达出现显著差异。GrA期2,266个基因表达高于其他组，其中233个TFs显著高表达。此外，93个转运蛋白相关基因、27个生长素相关基因、89个激酶相关基因、63个E3连接酶相关基因和36个活性氧（ROS）相关基因在该期显著上调。GO富集分析显示高表达基因富集于脂质分解代谢过程、细胞壁和过氧化物酶活性。
对三个发育阶段均高表达的基因进行分析，发现2,554个上调基因（定义为在所有三个时期均高表达的基因）。选择三个花序发育阶段FPKM值均大于100的基因进行进一步分析，发现10个TFs表达显著高于两周龄幼苗叶片。此外，3个转运蛋白相关基因、2个生长素相关基因、10个激酶相关基因、2个E3连接酶相关基因和1个ROS相关基因在三个发育时期均显著上调。GO富集分析表明高表达基因富集于核小体组装、脂肪酸生物合成过程、蛋白质异源二聚化活性和核小体。
谷子发育花序关键基因表达特征
在控制花器官特性的ABCDE遗传模型中，MADS-box同源基因对植物生殖生长和花器官发育具有多效性。转录组分析鉴定出30个表达发生变化的MADS-box基因。RNA-seq结果显示，仅4个基因优先在两周龄幼苗中表达，大多数MADS家族基因在花序发育三个阶段高表达。在花序发育早期，大多数MADS家族基因在GrA期表达显著增加。SiMADS1（Seita.9G490400）在GrA期表达最高，FPKM高达1000，表明MADS-box在谷子花序发育中具有重要作用。
组蛋白是细胞周期不可或缺的蛋白质，核心细胞周期调控因子通过修饰组蛋白模式操纵基因表达。转录组中发现许多参与细胞周期和细胞分裂的基因，如组蛋白、细胞周期蛋白和细胞分裂周期蛋白，这些基因可能是花序发育所必需的。大多数细胞周期蛋白、细胞分裂蛋白和组蛋白在BP和DR期高表达。其他与细胞周期调控相关的基因，如组蛋白乙酰转移酶，也在DR和BP期高表达。细胞周期基因的层次聚类分析显示，谷子花序发育的DR和BP期细胞周期活性相对较高。
茎顶端分生组织（SAM）稳态对植物发育至关重要，CLV-WUS负反馈环路通过调控中心区域干细胞数量维持SAM稳态。分析参与茎顶端分生组织发育的基因，并将其分为三组：分生组织信号相关基因、分生组织特性相关基因和与花序发育相关的调控因子。首先分析分生组织信号相关基因，如WUS和CLV，但数据分析发现没有CLV相关基因，仅有8个WUS相关基因，且在BP和DR期高表达。其次分析分生组织特性相关基因，如KN1和ANT（AINTEGUMENTA）。ANT是编码AP2结构域家族的转录因子，通过维持分生组织能力协调细胞增殖和细胞生长。大多数ANT在DR和BP期高表达。最后分析一些调控因子，如bHLH（碱性螺旋-环-螺旋）、FT（开花位点T）和SPL（SQUAMOSA启动子结合蛋白样），这些基因在花序发育中也起重要作用。在发育花序中检测到大多数bHLH、SPL和FT基因的转录本，其表达水平通常从DR期到GrA期逐渐降低。
RT-qPCR验证RNA-seq数据
为保证转录组数据的可靠性，选择6个基因进行RT-qPCR验证。具体分析了一个在DR期高表达的基因（Seita.5G428100-MSP1）。水稻MSP1基因编码富含亮氨酸重复序列的受体蛋白激酶，在花发育过程中启动花药壁形成起关键作用。分析了两个在BP期高表达的基因（Seita.8G251800-类硫素肽）。分析了四个在GrA期高表达的基因（Seita.9G490400-SiMADS1、Seita.6G134800-THI2、Seita.8G032600-纤维素酶/内切葡聚糖酶和Seita.7G301000-LTP110-B）。脂质转移蛋白（LTPs）已被证明在花粉发育中起重要作用。RT-qPCR数据显示基因表达水平变化与RNA-seq数据一致，表明分析结果可靠。
CRISPR-Cas9系统验证SiMADS1功能
转录组分析显示SiMADS1在GrA期表达非常高。先前研究表明MADS1调控大麦和水稻的花序发育，但在谷子中尚未报道。为验证SiMADS1在谷子中的功能，通过CRISPR-Cas9系统在Ci846背景中敲除SiMADS1。两个靶点间距7bp，均位于SiMADS1第一外显子。共鉴定出25株阳性转基因植株，具有6种编辑类型。选择两个株系（simads1-4和simads1-7）进行植株表型分析。分析显示，与野生型（WT）相比，敲除株系结实率较低。籽粒大小和百粒重测量结果显示，籽粒长、籽粒宽和百粒重无显著差异。选择simads1-4进行表型分析，鉴定出五种不同的花表型：I型（5.44%，n=441），特征为每个圆锥花序有双花；II型（57.37%，n=441），表现为内部花器官缺失；III型（8.17%，n=441），显示柱头发育不良；IV型（23.58%，n=441），特征为花药缺失；V型（5.44%，n=441），表现为胚珠缺失。这些发现表明SiMADS1在决定花器官特性中起重要作用。
结合RNA-seq和DAP-seq鉴定SiMADS1下游调控基因
为阐明SiMADS1调控谷子花序发育的分子机制，对WT和simads1在GrA期和圆锥花序期进行转录组测序，并进行差异基因表达分析。为更好地寻找SiMADS1下游调控基因，进行了SiMADS1的DAP-seq。共鉴定出20,792个peak，其中3.38%位于外显子区，9.45%位于内含子区，66.81%位于基因间区，20.36%位于启动子区。将DAP-seq分析鉴定的7,283个基因与两个时期的DEGs重叠，试图鉴定SiMADS1直接调控的靶基因。维恩图显示GrA期有155个重叠基因，圆锥花序期有215个重叠基因。GO富集分析结果显示，GrA期靶基因更集中于心皮发育、花器官形态发生、植物型子房发育和花分生组织决定性。圆锥花序期靶基因富集于基因表达调控、雄蕊发育、雄蕊形成和植物型子房发育。
为进一步鉴定SiMADS1下游调控基因，单独富集启动子区基因。结果显示GrA期没有与花发育相关的靶标，而圆锥花序期靶标富集于花发育、花轮发育、花器官形成和心皮形态发生。因此，选择圆锥花序期与花发育相关的基因（EAT1、HEC1、MADS2、MADS22、YAB1）进行RT-qPCR。这些基因在花序发育中起重要作用。RT-qPCR结果显示，这些基因与WT相比下调，表明这些基因可能受SiMADS1正调控。
讨论
花序发育与作物产量密切相关。尽管先前报道了一些调控花序发育的基因，但谷子花序发育过程研究较少。因此分析比较了谷子花序不同发育阶段的转录组与两周幼苗转录组。本研究为深入解析谷子穗发育分子机制提供了新的遗传资源。利用CRISPR-Cas9基因组编辑对SiMADS1进行功能验证。RNA-seq和DAP-seq数据整合分析进一步鉴定了其下游靶基因。这些发现增强了我们对花序发育分子机制的理解，为未来相关基因功能研究提供了宝贵资源。
在花序发育早期，细胞分裂和细胞周期起关键作用。在谷子DR和BP期，细胞周期相关调控因子、细胞周期蛋白和组蛋白优先表达，表明细胞增殖和分化活跃，导致花器官形成。此外，GrA期高表达基因富集于细胞壁成分，也揭示了谷子发育后期花器官的活跃生长。先前研究表明拟南芥中WUS激活后，80S核糖体蛋白和60S核糖体蛋白表达水平降低。本研究发现40S核糖体蛋白和60S核糖体蛋白在DR和BP期均高表达，表明其在谷子中的表达模式可能不同，但需要更具体的研究。
先前研究表明大麦中WUS在DR期表达最高，谷子在DR和BP期表达较高，但在谷子中未发现CLV同源基因。发现一类编码类硫素肽的基因表达非常高。因此推测这些基因可能是谷子中的特异类群，具有与CLV相似的功能，但需要进一步研究。KNOX家族成员根据序列和表达模式进一步分为两类：I类基因对茎顶端分生组织的形成和维持至关重要，而II类基因表达模式因基因而异。KN1同源基因在谷子DR和BP期高表达，表明其在谷子花序发育中的功能保守。
先前研究表明非特异性脂质转移蛋白在花药发育中起关键作用。在simads1转录组中发现许多非特异性脂质转移蛋白，这些基因表达与WT相比显著降低，表明非特异性脂质转移蛋白可能受SiMADS1调控，但具体调控机制需要进一步基因研究。
MADS-box在植物发育中起关键作用。迄今为止，已在拟南芥、水稻和大麦中研究了一系列MADS-box基因。先前研究表明SiMADS34可通过调控花序发育影响籽粒产量，但其种子大小不变。SEP亚家族成员是被子植物花序发育的关键调控因子。OsMADS1被认为是SEP样基因成员。本研究显示SiMADS1敲除株系可导致花器官缺失和发育异常
