《Plant Science》：Probing Cellular Landscapes in Plants via Single-Cell Transcriptomics
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植物单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术为解析细胞异质性和发育机制提供了高分辨率方法，但其与功能基因组学和空间技术的整合仍存局限。本文综述了scRNA-seq在揭示植物多组织发育轨迹、细胞命运决定及胁迫响应中的进展，强调其在候选基因挖掘（如CRISPR验证）和跨物种应用中的潜力，同时批判性评估了技术挑战并提出解决方案，为精准育种提供理论支撑。
Babar Usman|Naveed Khan|Yiming Wang|Ravi Gupta|Soon Wook Kwon|Sun Tae Kim
韩国釜山国立大学生命与工业融合研究所植物生物科学系，密良
摘要
单细胞RNA测序（scRNA-seq）显著提升了我们解析植物细胞异质性和发育过程的能力，其分辨率达到了前所未有的水平。然而，将其与功能基因组学和空间技术在植物系统中的整合仍然有限，这导致我们在理解基因调控、应激反应和细胞命运决定方面存在关键空白。在这篇综述中，我们全面总结了scRNA-seq在多种植物组织中的应用，展示了这些数据集如何揭示了发育轨迹、谱系动态以及细胞类型特异性的转录程序，包括细胞身份转变和发育可塑性。我们进一步强调了scRNA-seq如何揭示细胞层对非生物和生物应激的特异性反应，以及其在追踪特定代谢产物的产生和单细胞分辨率下解析突变效应方面的新兴作用。值得注意的是，scRNA-seq能够精确识别候选基因，并通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑来验证这些基因的功能，从而增强特定性状。我们还探讨了空间转录组学的最新进展以及结合转录组数据与染色质可及性或蛋白质表达的多组学方法。独特的是，我们的综述整合了不同植物物种和组织类型的见解，提供了关于植物发育和适应性的跨学科视角。最后，我们批判性地评估了主要的技术挑战，如原生质体分离、标记基因的有限可用性以及细胞类型注释，并提出了潜在的解决方案。总体而言，这篇综述及时概述了单细胞和空间转录组学如何通过提供高分辨率的植物组织发育和应激反应见解来推进基因发现和性状改良。
引言
生物体由具有不同形态和专门功能的细胞组成，不同细胞类型的基因表达模式各不相同，这推动了细胞分化并使它们能够发挥不同的生物学作用（Arendt等人，2016年）。单细胞组学的进步现在使得对细胞类型特异性基因表达的解析达到了前所未有的水平，揭示了塑造细胞身份的转录程序。通过在发育和稳态过程中分析离散的细胞群体，我们可以定义在空间和时间上指导细胞身份的调控网络（Wang等人，2023a）。这些知识阐明了特化细胞是如何出现并协调构建复杂组织的。
转录组学或RNA测序（RNA-seq）能够对组织或细胞中的蛋白质编码和非编码RNA进行高通量分析（Wang等人，2009年）。批量RNA-seq已被广泛用于研究三十多年来的组织间全局基因表达（Tyagi等人，2022年），但所得的平均表达值掩盖了细胞间的异质性。由于单个细胞在基因表达和调控方面表现出显著差异（Rosenfeld等人，2005年），全组织转录组学限制了我们对细胞类型特异性网络、稀有细胞群体和发育转变的解析能力（Shaw等人，2021年）。因此，单细胞分析对于捕捉支撑组织结构和功能的精细基因表达动态至关重要。
单细胞RNA测序（scRNA-seq）可以在单细胞分辨率下分析转录组，根据高通量表达谱型区分细胞类型，并重建发育轨迹（Efroni和Birnbaum，2016年）。因此，scRNA-seq可以通过描绘离散细胞群体之间的转录差异来揭示调控细胞分化和组织发育的调控网络。这篇综述总结了植物scRNA-seq的关键原理，从实验设计到计算分析，并强调了其在不同物种中的应用进展。近年来，单细胞转录组图谱已逐渐应用于模式植物（如拟南芥（Zhang等人，2019a）和苜蓿（Cervantes-Pérez等人，2022））以及重要的农作物（包括水稻（Liu等人，2021a，Wang等人，2021）、玉米（Xu等人，2021a）、高粱（Fu等人，2024）、棉花（Qin等人，2022）、草莓（Bai等人，2022）、番茄（Omary等人，2022）、茶树（Wang等人，2022）、大豆（Sun等人，2023a）等），以研究植物发育的遗传调控（Cho等人，2025）。
scRNA-seq技术的概述、历史和演变
最初，转录组技术依赖于PCR和微流控平台来捕捉细胞转录的快照，为scRNA-seq研究的进步奠定了基础（Kurimoto等人，2006年）。2009年，当mRNA-seq应用于小鼠四细胞期胚胎的个别囊胚时，单细胞基因表达分析的概念应运而生，使得能够分析卵母细胞和早期胚胎等稀有细胞类型（Tang等人，2009年）。然而，早期的方法
植物scRNA-seq样品制备和数据分析的简要概述
在植物中，坚硬的细胞壁以及原生质体分离过程中由应激引起的转录变化需要专门的方法（Chen等人，2023a；Patil等人，2022；Sharma等人，2020）。即使经过优化，标准的酶消化也会引发全基因组的应激反应。为了最小化这些干扰，单核RNA测序（snRNA-seq）使用冰冷提取缓冲液来保持天然的转录状态，尤其是在难以处理的组织（如根）和单子叶植物中（Xu
scRNA-seq成功应对了植物组织的特异性细胞环境
scRNA-seq能够在数万个细胞上进行全基因组表达分析，从而精确识别各种细胞亚群，并以高分辨率揭示表达异质性。因此，scRNA-seq技术可以构建不同异质细胞的转录组图谱，挖掘细胞亚群间的关键分化基因，并用于分析植物组织发育机制，探索植物细胞的动态发育轨迹
特异性代谢产物的检测以及应激和营养响应的解码
scRNA-seq有助于通过识别细胞类型特异性的生物合成途径和与次级代谢产物生成相关的基因表达谱型来检测植物中的特异性代谢产物。它还能通过揭示单细胞分辨率下的转录组变化来识别突变效应，确定特定细胞类型和发育过程是如何改变的。此外，scRNA-seq还能解析植物对多种应激的反应植物中的空间转录组学应用
空间转录组学（ST）作为一种变革性工具，能够在植物组织中实时和空间上绘制基因表达图谱，克服了scRNA-seq的关键限制，保留了空间背景，并能够分析细胞间的相互作用和组织结构。早期在拟南芥（Arabidopsis）、杨树（Populus tremula）和冷杉（Picea abies）等植物中的实现使用了条形码微阵列（约10微米厚），但分辨率较低（每个点约100微米，每个样本约1000个点）scRNA-seq为基于CRISPR/Cas的基因编辑提供了候选基因
scRNA-seq已成为一种变革性工具，用于性状工程，能够精确靶向可以通过CRISPR进行修饰的复杂调控因子。在这里，我们强调了scRNA-seq的关键示例，它实现了从细胞类型解析预测到基因组编辑的直接转化（图4）。例如，scRNA-seq鉴定出MYB25样蛋白、HD1和HOX3是棉花纤维形成的关键调控因子。CRISPR敲除MYB25后产生的种子完全无毛，而HOX3突变体则表现出
将scRNA-seq应用于植物的挑战和新兴解决方案
尽管scRNA-seq和ST在植物生物学中具有巨大的潜力，但由于技术和生物学上的障碍，其应用仍然具有挑战性。植物单细胞和ST组学中的剩余空白主要集中在三个方面：（i）植物特异性的样品制备瓶颈；（ii）缺失的检测方法和试剂；（iii）分析和标准化的不足。单细胞组学在精准育种和未来方向中的应用
高分辨率的单细胞和空间图谱为改造植物育种和工程提供了所需的细胞级信息。通过揭示控制耐旱性、免疫力、养分利用或产量形成等性状的细胞状态，单细胞数据能够实现细胞类型特异性的性状解析。这些见解使得能够靶向相关细胞类型中表达的精确调控基因，最小化多效性并显著提高精准育种的效率。单细胞eQTL资助
本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）的支持，该基金会由教育科学技术部资助（项目编号RS-2024-00344229，RS-2025-02213915），同时也得到了韩国农村发展行政部的资助（RS-2025-02214096）。CRediT作者贡献声明
Soon Wook Kwon：撰写——审稿与编辑、可视化、验证。Sun Tae Kim：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、验证、监督、资源管理、项目管理、数据管理、概念构思。Babar Usman：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、可视化、研究、数据管理、概念构思。Naveed Khan：初稿撰写、可视化、研究、数据管理。Yiming Wang：撰写——审稿与编辑利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。致谢
作者感谢Madhusudhana R. Janga、Leonidas Dagostino、Degao Liu、Gunvant Patil和Mohsin Niaz对手稿提供的宝贵意见和讨论。
