用于通用有机磷农药检测的“瘦身”探针技术：单探针-Cas12a集成策略的开发与验证

《Talanta》：Process “slimming” sword for universal organophosphorus pesticide detection: Development and validation of a single-probe-Cas12a integrated strategy

氯氟吡嗪（CPF）检测中，基于CRISPR/Cas12a的LAC策略通过DNA激活器双态机制实现高效电化学传感，结合分子对接模拟验证 CPF与适配体的特异性结合，构建两步快速检测体系，在复杂基质中展现出高特异性和灵敏度。

　　

Xu Liu|Di Yang|Bingqian Liu

贵州大学药学院合成药物工程实验室，中国贵阳550025

摘要

鉴于氯吡硫磷（CPF）在农产品中的不可逆神经毒性和高检出率，开发出灵敏且高效的CPF传感器迫在眉睫。本文构建了一种新型的锁定激活剂-Cas12a（LAC）策略，该策略具有“简化”反应过程的能力。该策略基于一种具有两种状态的DNA激活剂，这两种状态在反应中起着关键中介作用。通过目标物质诱导产生的大量激活剂进一步增强了生物传感器的效能，确保了整个反应的顺利进行，从而能够在复杂基质中实现精确可靠的CPF检测。此外，我们利用生物信息学资源（包括AutodockVina）通过分子对接模拟研究了CPF与其适配体之间的分子相互作用机制。采用两步检测流程，这种方法简单易行，并且通过替换适配体序列可以轻松扩展到其他有机磷农药的检测。预计这些生物传感器可以作为农业样品中检测的强大工具，最终有助于提升人类健康和福祉。

引言

农药是控制害虫数量的关键，对农业和畜牧业等多个领域的发展具有重要意义[[1], [2], [3], [4], [5]]。其中，有机磷农药（OPs）由于有机氯杀虫剂的禁用而受到广泛关注[[6]]。在各种有机磷农药中，CPF因其成本较低且对种子发芽的影响最小而被广泛用于农业[[7,8]]。然而，CPF由于其不可逆的神经毒性和在食品中的高检出频率，对生态系统和动物健康构成了严重威胁[[9,10]]。更令人担忧的是，CPF在环境中可以转化为氯吡硫磷肟，这种代谢物的毒性据报道比CPF本身高10,000倍[[7]]。因此，开发准确且抗干扰的CPF检测方法已成为当务之急。

随着农药残留限量标准的进一步收紧，传统的色谱检测技术难以满足大规模筛查和现代食品安全监管的严格要求[[11], [12], [13], [14]]。近年来，用于基因编辑的强大工具——规律间隔短回文重复序列CRISPR/Cas（CRISPR相关）蛋白系统引起了科学界的广泛关注[[15], [16], [17]]。在之前报道的基于CRISPR/Cas12的有机磷农药检测策略中，大多数系统严重依赖于重金属离子（Mn²⁺, Pb²⁺）、酶或抗体。例如，一些研究利用Mn²⁺与CRISPR/Cas12系统结合来调节乙酰胆碱酯酶活性，从而构建有机磷农药荧光传感器[[18], [19], [20]]。Wang团队提出了一种结合链式杂交反应和CRISPR/Cas12a的竞争性免疫反应荧光系统，用于三唑磷的检测[[21]]。尽管这些方法取得了有希望的结果，但往往缺乏精确性和同类物质间的区分能力。最近，Tian团队将适配体与CRISPR/Cas12a结合，构建了一种便携式葡萄糖仪，用于高特异性地检测马拉硫磷[[22]]。虽然适配体的引入提高了CRISPR/Cas12a系统的靶向特异性，但这种方法需要 invertase和四种crRNA的复杂设计。更重要的是，现有的检测方法通常需要繁琐的3-6步操作流程，且检测步骤的数量与不可控因素的概率正相关，大大增加了检测结果误判的风险。因此，现有的CRISPR检测系统仍然面临缺乏简单通用方法的困境，难以在复杂基质中准确识别目标物质。作为替代方案，电化学生物传感器以其灵敏度、特异性、成本效益、长期稳定性、实时监测和低样品量需求而闻名[[23], [24], [25]]。在将CRISPR-Cas12a应用于电化学检测方法方面已经取得了显著进展[[26], [27], [28], [29]]。据我们所知，尚未有将CRISPR/Cas系统整合到电化学生物传感器中用于检测有机磷农药的报道。

在本研究中，我们开发了一种基于目标激活的LAC非特异性切割活性的新型CPF检测方法，以CPF作为模型目标。如图1所示，激活剂在两种状态下起连接作用：一种是DNA激活剂序列被CPF适配体“锁定”的状态（“锁定激活剂状态”），另一种是在目标诱导的适配体脱离后自由DNA恢复的状态（“开放激活剂状态”）。crRNA识别并结合到开放激活剂上，有效促进了后续的CRISPR/Cas12a对单链DNA（ssDNA）探针的非特异性切割。最初，完整的探针由于静电排斥和空间阻碍而阻碍了[Fe(CN)₆^3?/4?的接近。一旦探针从电极表面移除，K₃[Fe(CN)₆]的有效通量增加，从而显著增强了电化学信号。值得注意的是，所提出的LAC策略为复杂基质中的CPF检测提供了一个简单的生物传感平台，表现出强烈的同类物质选择性和精确性。

试剂和设备

五水合硝酸铋（Bi(NO₃)₃?5H₂O）、柠檬酸钠（Na₃C₆H₅O₇?nH₂O）、醋酸镉（Cd(OCOCH₃)₂、硫脲（CH₄N₂S）和氢氧化铵（H₅NO）均来自上海Macklin有限公司（中国）。醋酸锌（C₄H₆O₄Zn?2H₂O）和十二水合磷酸二钠（Na₂HPO₄·12H₂O）购自天津Macklin有限公司（中国）。氯化钾（KCl）、氯化钠（NaCl）和氰化铁钾（K₃[Fe(CN)₆）购自成都金山化工

LAC生物传感器机制的多维度验证

为了开发LAC电化学生物传感器，我们采用了Cheng等人描述的氯吡硫磷适配体的寡核苷酸序列结构[[35]]。基于此，构建了一个包含适配体、激活剂和crRNA的复合检测系统（图1A和表S1）。然而，仍有三个问题需要验证：（1）氯吡硫磷是如何特异性地结合到适配体上的？（2）激活剂能否成功锁定和释放？（3）目标介导的开放过程是否正常进行

结论

总体而言，本研究提出了一种新型的LAC策略，将CRISPR-Cas12a系统与单个单链DNA探针结合，仅需两步检测流程即可在40分钟内完成CPF的检测。值得注意的是，这项工作作为“简化”反应过程的工具，首次实现了基于Cas12a的有机磷农药电化学检测应用，填补了当前利用该技术的检测方法中的重要空白。此外，分子动力学（MD）模拟也进一步验证了该策略的有效性

CRediT作者贡献声明

Xu Liu：撰写——初稿、验证、资源整理、数据管理。Di Yang：撰写——审稿与编辑、资源管理、方法学设计、数据管理、概念构思。Bingqian Liu：撰写——审稿与编辑、监督、研究资助、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

感谢国家自然科学基金（21864007）、贵州省卫生健康委员会科学技术基金（gzwkj2025-472, gzwkj2025-109）以及贵州大学基础研究项目（Gui Da Ji Chu [2024]41）的支持。同时，我们也感谢Editage（www.editage.cn）提供的英语语言编辑服务。