《TrAC Trends in Analytical Chemistry》：Recent progress in CRISPR-based paper sensors for nucleic acid detection
编辑推荐：
CRISPR/Cas系统与纸基传感器结合，开发了高特异性、灵敏的核酸检测技术，涵盖荧光、颜色、电化学、SERS及双模式信号策略，并集成lfas和微流控平台，通过水凝胶增强稳定性和深度学习辅助分析，推动便携快速检测发展。
刘玉清|叶尊忠|王瑞|潘玉祥|平建峰|应一斌|吴崔
浙江大学杭州全球科技创新中心，中国杭州，311215
摘要
基于CRISPR/Cas的生物传感器由于具有高特异性和信号放大能力，已成为核酸检测的强大工具。基于纸张的分析方法因其简单性、低成本和便携性而受到重视，为将CRISPR检测技术转化为即时检测（POCT）提供了有吸引力的平台。本文总结了基于CRISPR的纸张传感器在核酸检测方面的进展，重点关注两个方面：（i）信号输出策略，包括荧光、比色、电化学、表面增强拉曼散射（SERS）和双模式读数，这些方法能够提供交叉验证的结果；（ii）平台架构，主要集中在层析荧光分析（LFAs）和微流控分析设备上，这两种格式是基于CRISPR的纸张诊断中最具有实际应用前景的。我们还强调了功能增强技术，如水凝胶集成以提高试剂稳定性和反应稳健性，以及深度学习辅助分析，以实现客观、独立于用户的读数解释和自动化。总体而言，推动基于CRISPR的纸张传感器向完全集成的工作流程、无需扩增的操作、多目标检测能力和工业化开发方向发展，可以提高其实用性和稳健性，从而支持其在POCT和现场部署中的更广泛应用。
引言
病原微生物，包括细菌、病毒、真菌、原生动物和蠕虫，[1]，[2]，[3]，[4] 对全球公共卫生构成威胁。[5]，[6] 其中，病原体感染每年导致约770万人死亡，占全球死亡人数的13.6%。[7] 此外，耐药性病原体的出现使情况更加严峻。加强病原菌的监测并推广快速检测技术的应用尤为重要。[8]，[9]，[10]
随着科学技术的不断进步，病原体检测方法也在不断更新。传统的检测方法，如结合生理和生化指标的细菌培养，仍然因其简单性和区分死活病原体的能力而被广泛使用。然而，这些方法通常需要较长的检测周期，通常从三天到一周不等，这限制了它们在应对快速诊断日益增长的需求方面的有效性。[11] 为了解决这些限制，基于抗原-抗体相互作用的免疫测定技术和针对核酸检测的分子生物学技术相继被开发并应用于病原体的快速检测。[12]，[13] 例如，酶联免疫吸附测定（ELISA）具有高特异性，但相对耗时，且灵敏度有限；而免疫层析法可以实现快速和便携的检测，但其灵敏度仍有待提高。[11]，[14] 另一方面，以聚合酶链反应（PCR）[15] 为代表的分子生物学方法通过靶向病原体的特定基因区域提高了检测的灵敏度和速度。然而，这些方法依赖于昂贵的设备和专业的技术操作，限制了其在现场测试中的应用。[16]，[17]，[18]，[19]，[20] 虽然分子生物学技术为实验室中的高精度检测提供了有力支持，但免疫学方法凭借其便携性和低成本促进了现场快速检测的更广泛应用。[21]，[22]，[23]，[24]，[25] 这些技术进步为不同的公共卫生管理需求提供了互补的解决方案。每种检测方法都有其独特的优势和局限性，因此选择合适的检测策略对于实现快速、准确的病原体识别和有效控制至关重要。总体而言，病原体检测技术正朝着更高的灵敏度、更快的检测速度和更便携的操作模式发展，为实验室和现场环境中的更实用和可扩展的解决方案铺平了道路。
近年来，CRISPR（规律间隔短回文重复序列）系统不仅因其高特异性和可编程性彻底改变了基因编辑领域，而且在病原体检测方面也展现了巨大潜力。[26]，[27]，[28] 与传统的分子生物学检测方法相比，基于CRISPR的检测系统具有更高的灵敏度、更好的特异性和更快的检测速度，能够更高效地精确识别目标序列。
2016年，Collin等人首次将CRISPR/Cas9应用于寨卡病毒检测，标志着使用CRISPR/Cas系统进行核酸检测领域的重大突破。[29] 随后，Zhang等人在《科学》杂志上发表了一篇关于基于CRISPR/Cas13a的核酸检测技术SHERLOCK（Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing）的文章。在这种方法中，Cas13a蛋白被目标RNA激活，从而切割标记有荧光素的报告分子，实现了高灵敏度的检测，甚至可以识别单碱基突变。[30] 由2020年诺贝尔化学奖得主Jennifer Doudna领导的团队建立了另一种基于CRISPR的核酸检测平台DETECTR（DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter）。[31] Cas12a蛋白与目标双链DNA（dsDNA）结合，为核酸分析提供了强大的平台。SHERLOCK和DETECTR的发明和成功应用确立了CRISPR/Cas系统作为核酸检测的变革性工具，为快速、精确和多功能的诊断技术开辟了新的途径。
将核酸扩增技术与CRISPR/Cas系统结合，不仅能够实现目标核酸的超灵敏检测，还能识别单碱基突变。CRISPR/Cas系统具有温和的反应温度和强大的信号放大能力，具有应用于现场检测的潜力。目前，基于CRISPR/Cas的技术已经开发出了快速、简单且高效的核酸检测方法，为公共卫生和疾病预防控制提供了重要工具。[32]，[33]，[34]
基于纸张的传感器由于其低成本、易用性和便携性，已成为实现现场快速诊断的有前景的解决方案。[35]，[36]，[37] 这些传感器利用纸张的天然特性（如多孔结构和吸水性）来集成各种传感材料（例如金属纳米颗粒、酶、抗体、DNA探针等）。[38]，[39]，[40] 结合免疫测定和分子生物学技术，基于纸张的传感器可以通过比色、荧光或电化学信号实现核酸检测（图1）。[41]，[42]，[43]，[44] 此外，通过使用微流控设计来控制样品和试剂的流动，纸张可以用作具有良好生物相容性和液体流动特性的传感器基底材料。这消除了对外部泵的需求，并能够完成复杂的检测过程。此外，还开发并广泛使用了微流控纸质分析设备（μPADs）。[45]
近年来，结合CRISPR/Cas技术的基于纸张的平台已被开发用于核酸检测，为高特异性和成本效益高的诊断开辟了新的可能性。[46]，[47]，[48]，[49] 本文探讨了基于CRISPR的纸张传感器的最新进展，重点关注荧光、比色、电化学和表面增强拉曼散射（SERS）以及双模式检测方法。此外，我们还讨论了结合CRISPR/Cas系统的侧向流动设备和基于纸张的微流控系统，介绍了它们的设计特点、检测机制和应用。我们还讨论了基于CRISPR的纸张设备的功能增强，包括提高灵敏度和稳定性的水凝胶集成系统，以及提高检测准确性和可靠性的深度学习增强系统。最后，我们指出了当前面临的挑战，并提出了未来研究方向，以进一步提高基于CRISPR的纸张传感器在核酸检测方面的灵敏度、可扩展性和适用性。
部分摘录
基于纸张的分析策略的进展
结合CRISPR/Cas技术的基于纸张的分析设备（PADs）已成为快速、低成本和准确核酸检测的多功能平台。通过将CRISPR相关核酸酶（例如Cas12a、Cas13、Cas14、Cas9）与纸张基底集成，已经开发出了多种检测模式，如比色、荧光、SERS和电化学检测（如表1所示）。每种模式在灵敏度和仪器方面都有其优势。
侧向流动CRISPR检测
CRISPR系统与侧向流动检测（CRISPR-LFAs）的结合已成为一种变革性的方法，可以实现快速、无需设备的核酸检测。这种协同作用能够实现超灵敏、特异性强且结果易于视觉解读的特点，非常适合资源有限的现场应用。[64]，[65]，[66] 通常，LFA由样品垫、结合垫、带有测试（T）和对照（C）线的硝化纤维素（NC）膜以及吸水垫组成。
基于纸张的微流控分析设备
基于纸张的微流控分析设备是一种创新的微流控技术，利用纸张材料（例如纤维素膜、滤纸等）[79]，[80] 作为流体传输和处理的载体。通过设计微小的流动通道和反应区域，可以实现液体的引导、分离、混合和分析。[81]，[82]，[83] 与仅作为终端信号转换器的LFAs相比，基于纸张的微流控平台可以集成更多功能。基于CRISPR的纸张设备的功能增强
同时，CRISPR-PADs已成为资源有限环境中POCT的理想平台，因为它们具有便携性、低成本和易于操作的特点。[103]，[104] 然而，传统的CRISPR-PADs在信号放大效率、结果解释准确性和自动化方面仍存在局限性。为了解决这些挑战，研究人员利用了新型材料（例如水凝胶）和先进技术（例如深度学习）来优化检测性能，从而加速了检测过程。结论与展望
CRISPR/Cas系统作为一种尖端的生物传感技术，以其无与伦比的灵敏度和特异性在核酸检测中得到了认可。当与基于纸张的平台结合时，CRISPR/Cas系统在提供便携、低成本和用户友好的诊断解决方案方面展现了巨大潜力，特别是在资源有限的现场应用中。我们总结了CRISPR-PADs的不同信号输出方法和系统形式，重点关注两个方面
CRediT作者贡献声明
王瑞：撰写 – 审稿与编辑。叶尊忠：撰写 – 审稿与编辑，监督。刘玉清：撰写 – 原始草稿。吴崔：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，监督，资金获取。应一斌：监督，方法学。平建峰：监督，方法学。潘玉祥：撰写 – 审稿与编辑
致谢
本工作得到了中国浙江省自然科学基金（项目编号LZ25C130003）、国家自然科学基金（项目编号32572184和32371521）以及国家自然科学基金青年科学基金（项目编号32201649）的财政支持。
