《Experimental Cell Research》：Layer-by-Layer Coated Chitosan-CRISPR/Cas9 mTOR Nanoparticles: A Novel Approach to Inhibit Lens Epithelial Cell Proliferation and Migration for Preventing Posterior Capsule Opacification
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CRISPR/Cas9靶向mTOR的壳聚糖纳米颗粒通过LbL技术负载于人工晶状体表面，有效抑制人眼晶状体上皮细胞增殖迁移及后囊混浊形成，为长期防控提供新策略。
陈畅|杨嘉明|刘子明|陈佳宇|王冰莹|李俊青|刘红玲
中国黑龙江省哈尔滨市哈尔滨医科大学第一附属医院眼科
摘要
后囊混浊（PCO）是白内障手术最常见的并发症，也是导致视力障碍的重要原因。PCO的发生是由于残留的晶状体上皮细胞（LECs）的增殖、迁移以及上皮-间充质转化（EMT），这一过程由激活的mTOR信号通路驱动。先前的研究表明，在兔子模型中抑制mTOR活性可以有效减少LECs的增殖和EMT。然而，实现持续的mTOR抑制仍然是一个挑战。
在这项研究中，我们将针对mTOR的CRISPR/Cas9系统封装到平均大小为135纳米的壳聚糖纳米颗粒（Chi-gRNA）中。这些纳米颗粒具有抵抗DNase I消化的能力。为了延长释放时间，我们通过层层组装（LbL）技术将这些Chi-gRNA纳米颗粒结合到人工晶体（IOL）的表面。LbL涂层由交替的正电荷聚乙烯亚胺（PEI）和负电荷肝素层组成，在五个连续的循环中穿插着Chi-gRNA纳米颗粒。
光谱分析证实了纳米颗粒的成功整合和涂层效果，特征峰验证了各层的静电组装。体外实验表明，涂有Chi-gRNA的人工晶体显著抑制了人晶状体上皮细胞（hLECs）的增殖、迁移和黏附。
这些发现强调了LbL涂层人工晶体的潜力，可作为一种新型且有效的方法，用于在白内障手术患者中预防PCO。这种方法为这种常见的术后并发症的长期管理提供了有希望的途径。
引言
后囊混浊（PCO）是白内障手术后可能出现的常见并发症（Apple等人，2011年）。在儿童患者中，早期发生的PCO（手术一年内）非常普遍，发生率在40%到100%之间（Shihan等人，2019年；Louison等人，2019年）。在成人中，发病率较低，通常在10%到20%之间（Rakib-Uz-Zaman等人，2025年）。外科技术和人工晶体（IOL）材料的进步，特别是使用方形边缘的疏水人工晶体，显著降低了急性PCO的发生率，降至约2-4.5%。然而，晚期发生的PCO仍然是一个问题，病例通常在手术后5到10年出现（Rakib-Uz-Zaman等人，2025年）。
PCO的发展主要归因于手术后残留的晶状体上皮细胞（LECs）的增殖、迁移以及上皮-间充质转化（EMT）。尽管在白内障摘除过程中会尽力清除LECs，但位于晶状体囊赤道区域的LECs粘附性强，常常难以被手术去除。这些LECs随后可以增殖并迁移到后囊，在植入的人工晶体后方形成纤维化细胞层，最终影响视力（Wormstone等人，2021年）。在年轻患者中，LECs的较高增殖能力显著增加了早期PCO的风险。相比之下，晚期PCO通常是由于残留在Soemmering环内的LECs迁移至后囊并发生EMT，从而导致混浊和可能的视力下降（Donachie等人，2023年）。
为了解决这一挑战，人们探索了多种策略，包括外科技术、药物干预，以及最近的人工晶体表面改性方法，还有传统的药物浸泡或向囊内注射抗增殖剂如丝裂霉素C、5-氟尿嘧啶和紫杉醇（Li等人，2023年）。这些方法往往只能提供短期效果，并且存在对周围眼部组织产生毒性的风险。相比之下，人工晶体表面工程提供了一种局部且持续的方法来抑制LECs的黏附和增殖，同时不损害光学性能。例如，人工晶体表面的聚乙二醇化（PEGylation）可以增强亲水性，减少细胞黏附，并保持透明度和生物相容性（Xu等人，2016年）。光动力涂层结合氯e6可以在光照下产生活性氧，选择性地诱导LECs凋亡，从而有效预防PCO，且副作用最小（Tang等人，2021年）。
在这些策略中，基于壳聚糖的涂层因其兼容性、生物降解性和固有的抗黏附特性而显得特别有前景（Desai等人，2023年）。由透明质酸和壳聚糖组成的水合多糖多层结构显著提高了表面亲水性，并减少了LECs的黏附，同时保持了光学清晰度（Lin等人，2015年）。Han等人证明，使用三聚磷酸钠（TPP）进行纳米颗粒聚合，通过层层沉积正电荷壳聚糖纳米颗粒和负电荷HEP到人工晶体上，可以有效抑制兔子眼模型中的LECs黏附和增殖，而不影响光学性能（Han等人，2019年）。此外，壳聚糖纳米颗粒可以通过层层组装来递送抗增殖药物如多柔比星，显示出协同的抗黏附和抗增殖效果，并在体内实现强大的PCO抑制作用（Han等人，2019年；Han 2019年）。最近的创新包括酶响应性和pH响应性的多层涂层，其中包含甲基丙烯酸肝素和载有多柔比星的壳聚糖纳米颗粒，能够根据眼部微环境控制药物释放，进一步改善PCO的预防效果，同时不损害晶体的透明度（Han等人，2025年）。LbL技术允许沉积多层相反电荷的聚合物或纳米颗粒，形成稳定的结构，实现药物的持续释放。这种策略在人工晶体改性方面具有靶向递送和长期治疗效果的潜力。
我们之前的研究表明，哺乳动物mTOR信号通路在LECs增殖过程中被激活（Zhang等人，2016年）。作为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，mTOR调节细胞增殖和代谢。临床前研究表明，mTOR的抑制可以通过减缓LECs的增殖和EMT来延缓PCO的发展和形成（Liu等人，2009年）。我们假设，针对mTOR信号通路的基因靶向可能更有效地阻断LECs的增殖和EMT。
CRISPR/Cas9技术利用单个引导RNA（sgRNA）和Cas9内切酶选择性地编辑基因表达，在多种治疗场景中显示出潜力。例如，CRISPR介导的mTOR位点编辑增强了嵌合抗原受体T细胞（CAR T细胞）疗法对急性淋巴细胞白血病的疗效（Levesque S等人，2024年）。
基于这些进展，本研究将CRISPR/Cas9基因编辑与LbL涂层技术相结合。具体来说，将针对mTOR的CRISPR/Cas9复合物封装到壳聚糖纳米颗粒中，并通过LbL涂层技术沉积到人工晶体表面。主要目的是评估该系统在减弱mTOR信号传导、抑制LECs增殖和黏附方面的有效性，从而预防PCO。
CRISPR/Cas9-mTOR gRNA克隆
设计了三种针对mTOR的gRNA，分别抑制mTOR异构体1和异构体2（表1），并使用BsmBI限制性内切酶将其克隆到CRISPR/Cas9质粒lentiCRISPR v2（Corues Biotechnology，南京，中国）中。通过Sanger测序验证了含有这三种mTOR gRNA的lentiCRISPR v2质粒，确认了gRNA序列的插入（补充图1）。在人晶状体中检测了lentiCRISPRv2-mTOR gRNA的效率
针对mTOR的CRISPR/Cas9-sgRNA的克隆和验证
三种针对mTOR基因的引导RNA被插入到CRISPR Lenti-v2质粒中（补充图1）。将这些质粒转染到HLE-B3细胞后，mTOR蛋白的水平显著降低（图2a和b）。删除mTOR还减少了AKT和P70S6K的磷酸化，而不影响它们的蛋白水平（图2a和b）。AKT和P70S6K是已知的mTOR下游效应器（Zhang等人，2016年）
Chi-sgRNA纳米颗粒的优化
优化了Chi-sgRNA纳米颗粒，以达到目标尺寸
讨论
在这项研究中，我们提出了一种新颖的双策略方法，结合了CRISPR/Cas9介导的基因编辑和壳聚糖纳米颗粒在人工晶体上的LbL涂层。通过将CRISPR-mTOR sgRNA质粒封装到壳聚糖纳米颗粒中，并通过LbL组装技术应用到人工晶体上，我们证明了LbL涂层Chi-sgRNA纳米颗粒能够显著减少LECs的增殖，抑制其迁移并防止黏附，同时具有较低的细胞毒性。之前的研究使用雷帕霉素来抑制mTOR
CRediT作者贡献声明
陈畅：研究工作。杨嘉明：撰写——初稿。王冰莹：数据管理。李俊青：资源提供。刘子明：撰写——初稿。陈佳宇：研究工作。刘红玲：撰写——审稿与编辑、项目监督、资金获取、数据管理
未引用参考文献
Celojevic等人，2012年。
资金来源
本研究得到了国家自然科学基金（81301325）和眼科新技术孵化基金项目（FB2022008629）的支持
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
