《Viruses》：A Portable One-Tube Assay Integrating RT-RPA and CRISPR/Cas12a for Rapid Visual Detection of Eurasian Avian-like H1N1 Swine Influenza Virus in the Field
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本文开发了一种创新的一管式双信号检测平台，将逆转录重组酶聚合酶扩增（RT-RPA）与CRISPR/Cas12a技术相结合，实现了欧亚类禽H1N1猪流感病毒（EA H1N1 SIV）的快速现场检测。该检测方法以血凝素（HA）基因保守区为靶点，检测限达2 copies/μL，30分钟内即可完成，且与RT-qPCR符合率达94.18%。该技术具备高特异性、操作简便及设备便携等优势，为猪流感现场监测提供了重要技术支撑。
引言
猪流感（SI）是由甲型流感病毒（IAV）引起的高度传染性猪呼吸道疾病。病毒重配是产生具有新生物学特性流感病毒的主要机制，可能导致灾难性的人类流行病和大流行。历史上，1957年、1968年和2009年的大流行IAV毒株均起源于人和动物流感病毒的重配株。猪作为IAV的天然宿主，对禽、猪和人类流感病毒均易感，因此成为产生具有大流行潜力新型流感病毒的关键"混合容器"。欧亚类禽H1N1猪流感病毒（EA H1N1 SIV）于1979年首次在欧洲分离到。近期研究表明，该病毒亚型通过持续传播已成为中国猪群中的优势毒株，并证实其具有哺乳动物适应和传播能力，凸显了其大流行潜力。值得注意的是，国内外已报道多起人类感染病例。因此，开发快速、灵敏且易于部署的EA H1N1 SIV检测方法对其有效监测和管理至关重要。
传统猪流感检测方法包括血凝和血凝抑制试验（HA/HI）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、病毒分离（VI）和逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）。虽然VI能够获得完整的活病毒用于后续研究，但其检测周期长，不适合现场临床检测。HA/HI assay尽管操作简单、快速，但灵敏度有限，不适用于早期诊断。ELISA和RT-qPCR因其操作简单、特异性高和通量能力，在流感病毒检测中得到广泛应用。然而，这些技术需要专业人员和复杂的实验室基础设施，极大地限制了其在现场检测场景中的应用。
近年来，等温核酸扩增技术作为PCR的有前景替代方案发展迅速，包括环介导等温扩增、交叉引物扩增、链置换扩增、滚环扩增、核酸序列依赖性扩增和重组酶聚合酶扩增（RPA）。其中，RPA技术因其高灵敏度、优异特异性、设备独立性和操作简单性而备受关注，特别适合资源有限环境和现场检测的诊断应用，已被广泛应用于病原体检测和转基因生物分析等领域。
CRISPR/Cas系统由成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关蛋白（Cas）组成。近年来，基于CRISPR/Cas的诊断技术成为科学关注的重点。除了在生物和医学研究中的应用外，CRISPR/Cas系统已发展成为强大的分子检测工具。CRISPR/Cas12a（也称为Cpf1）在开发高性能诊断工具方面展现出显著潜力。2018年，Doudna团队首次报道了DNA内切酶靶向CRISPR反式报告基因（DETECTR）平台，利用Cas12a的反式切割活性成功检测了人乳头瘤病毒（HPV），标志着分子诊断领域的重大进展。随后，众多研究人员利用Cas12a的独特性质开发了多种病原体检测方法。
材料与方法
本研究在哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室保存了pMD-18T-EA HA质粒和毛螺螺旋菌Cas12a（LbCas12a）蛋白。临床拭子样本和各种猪流感病毒亚型，包括经典H1N1（CS H1N1）、2009年大流行H1N1（2009/H1N1 pdm）、H3、H5、H6、H9和EA H1N1，均由哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室保存和维护。
其他病毒毒株，如猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪圆环病毒（PCV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和轮状病毒（RV）由哈尔滨兽医研究所和哈尔滨维科生物技术开发公司的各个研究团队提供。
实验使用了Thermo Fisher公司的RNase抑制剂，北京睿博生物科技公司合成的荧光探针、CRISPR DNA（crDNA）和特异性RT-RPA引物，天根生化科技的RNA提取试剂盒，吉诺生物科技的RT-RPA试剂盒，生工生物科技的RNA纯化试剂盒，以及New England Biolabs的T7转录试剂盒和NEBuffer? r3.1。荧光信号使用QuantStudio 5系统采集，可视化结果通过智能手机在蓝光照射下拍摄保存。
实验原理基于RT-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法，通过靶向HA基因的保守片段，建立了EA H1N1 SIV的单管等温检测系统。简要来说，目标序列通过RT-RPA反应扩增，然后使用CRISPR/Cas12a系统进行检测，以荧光作为检测信号输出。
病毒核酸提取使用天根生化科技的RNA提取试剂盒进行，所有样本提取后于-80°C保存备用。
crRNA、RT-RPA引物和荧光探针的制备过程中，基于NCBI数据库下载的319条EA H1N1 SIV HA基因序列，使用MEGA11.0进行序列比对以识别保守区域。选择PAM序列后HA基因中约21 nt的保守片段作为目标DNA，据此设计了7个crRNA。在crRNA直接重复片段5'端添加T7启动子序列，合成ss-crDNA及其互补序列，通过37°C退火12小时获得ds-crDNA，使用T7转录试剂盒进行转录，产物经RNA纯化试剂盒纯化获得crRNA。荧光探针序列5'-[6FAM]TTATT[BHQ1]3'由北京睿博生物科技公司合成。
使用pMD-18T-EA HA质粒作为模板，制备含LbCas12a和设计crRNA的Cas12a反应体系，37°C反应40分钟后，通过智能手机在蓝光下拍摄图像筛选crRNA。基于最优crRNA，设计了5对RT-RPA引物扩增目标区域，选择效率最高的引物对作为最优RT-RPA引物组。
通过单变量方法优化一步反应条件，依次评估了RT-RPA反应温度（37°C和42°C）、体积（2μL、5μL、10μL、15μL、20μL）和时间（5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟）。随后对crRNA浓度（10μM至10pM）、LbCas12a浓度（10μM至10pM）和荧光探针浓度（500pM至5pM）进行梯度优化。
结果
crRNA、RT-RPA引物的设计与筛选及荧光探针的制备结果显示，crRNA4表现出最高的荧光强度和最佳的可视化检测效果，因此被选为最优crRNA。基于选定的最优crRNA，五对RT-RPA引物中F4/R4表现出最高的荧光强度和明显的可视化结果，因此被选为最优RT-RPA引物对。
优化的RT-RPA-CRISPR/Cas12a检测系统最终确定的最佳条件为：RT-RPA反应（37°C、5μL、10分钟）和CRISPR/Cas12a反应（crRNA-1μM、LbCas12a-10μM、ssDNA探针-5pM、20分钟）。实验流程包括：首先制备RT-RPA反应混合物，将4.5μL混合物与0.5μL核酸提取物混合置于管底；同时制备Cas12a反应混合物，充分混合后置于管盖中；RT-RPA反应在37°C避光进行10分钟，随后离心使管盖中的Cas12a系统与管底的RT-RPA系统充分混合；混合物在37°C QuantStudio 5系统中孵育20分钟，每分钟采集荧光信号；完成后记录荧光值，并通过智能手机在蓝光下拍摄图像。
分析灵敏度与特异性评估显示，该检测方法能够检测低至2 copies/μL的核酸浓度，表现出显著的荧光强度。特异性实验结果表明，仅在EA H1N1 SIV组中观察到显著的荧光强度和可视化检测，而与其它常见猪病毒或猪流感病毒亚型无交叉反应。
临床拭子符合率检测中，对86份临床鼻拭子样本（60份病毒分离阳性，26份阴性）使用商业RT-qPCR和RT-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法进行平行测试。阳性样本显示高荧光强度和明显的可视化结果，而阴性样本无荧光信号或可视化检测。该方法与商业RT-qPCR assay具有高度一致性，符合率达94.18%。
讨论
EA H1N1病毒在欧洲和中国猪群中的广泛流行，以及其在多个国家引起人类感染和高效传播的能力，表明该病毒具有大流行潜力。因此，开发特异性、灵敏且快速的EA H1N1病毒检测方法对于有效监测和控制猪流感至关重要。
crRNA作为关键组分，需要至少17个或更多碱基对与目标DNA匹配才能完全激活Cas12a的非目标切割活性。然而，当匹配少于20个碱基时，Cas12a的反式切割活性显著降低。LbCas12a识别5'端富含胸腺嘧啶（T）的PAM序列。对于目标dsDNA，PAM序列的修饰或PAM附近"种子区域"的错配可显著抑制ssDNA的反式切割活性。在结合、识别和切割位点激活过程中，LbCas12a由crRNA引导并呈现多种构象，这些构象状态之间存在高度动态和可逆的转换。这些发现表明目标DNA必须满足多个严格条件，理论上基于目标DNA设计的crRNA具有高度特异性。
为满足临床POCT要求，开发的检测方法必须整合多种优势，包括成本效益、快速周转、制备简便和独立于复杂设备。因此，结果展示系统需要与适当且简单的生物传感器集成。通常，比色生物传感器的检测限为10-100 copies/反应。然而，电化学和微流控生物传感器在制造方面存在挑战且成本高昂。本研究选择了荧光生物传感器，其肉眼可见结果且仅需简单的LED蓝光设备，非常适合现场检测应用。
研究表明，Cas效应子的催化效率随荧光报告基因长度而变化，10-T报告基因比经典报告基因（TTATT）具有更高的切割率和检测灵敏度。实验中用10-T报告基因替代TTATT，探针序列为5'-[6FAM]TTTTTTTTTT[BHQ1]3′（10T）。结果显示在相同条件下，10-T报告基因产生更强的荧光信号和更明显的可视化结果。然而，实验发现阴性对照中背景信号升高，呈现明显发光。调查影响10-T性能的潜在因素，包括RT-RPA组分、LbCas12a、crRNA、NEBuffer? r3.1和强光照射，结果表明LbCas12a对10-T影响最显著，其次是RT-RPA反应。为确保可控的荧光值和可视化结果，最终选择经典荧光报告基因（TTATT）用于后续实验。
RT-RPA反应可为CRISPR/Cas12a系统提供充足的目标扩增子。然而，常规方案需要打开反应管将扩增产物转移至CRISPR/Cas12a检测系统，这显著增加了气溶胶污染和潜在假阳性结果的风险。此外，研究表明在单管反应中，Cas12a介导的底物切割与等温扩增竞争，无法在同一缓冲系统中高效进行两个反应而不影响检测性能。为解决这些挑战，本研究通过物理分离两个反应系统，开发了一种创新的EA H1N1 SIV单管检测方法。RT-RPA反应置于离心管底部，而CRISPR/Cas12a反应组分预装在管盖中。等温扩增完成后，短暂离心混合两个系统进行后续反应。该设计消除了产物转移相关的气溶胶污染风险，同时使扩增反应和Cas12a介导的切割均能最佳进行，而不影响整体检测灵敏度。
总结
本研究成功开发了基于RT-RPA和CRISPR/Cas12a的EA H1N1 SIV一管式现场可视化检测平台。这种新型检测方法表现出优异的特异性、高灵敏度（检测限2 copies/μL）、快速周转时间（30分钟）、制备简便和设备需求最小化。该方法在EA H1 SIV的现场检测方面显示出巨大潜力，为EA H1N1 SIV的监测和控制计划提供了有价值的应用前景。
