《Journal of Fungi》：Screening of Monokaryotic Strains of Ganoderma sichuanense for Gene Editing Using CRISPR/Cas9
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本研究成功构建了一个整合七种关键元件的双sgRNA CRISPR/Cas9基因编辑平台，首次在四川灵芝（Ganoderma sichuanense）中系统筛选了适用于基因编辑的单核受体菌株。研究证实基因编辑效率存在显著的基因型依赖性，并成功编辑了生长、发育及代谢相关的多个功能基因，为灵芝属真菌的功能基因组学研究与遗传改良提供了强有力的技术支撑和宝贵的菌株资源。
摘要
四川灵芝是一种广泛使用的药食同源大型真菌。基因组学研究揭示其不同菌株间存在显著的遗传变异，表明针对一种基因型优化的遗传转化系统可能对其他基因型无效。然而，尚无研究系统评估不同基因型间遗传转化系统的效率，这在一定程度上限制了该物种的功能基因研究。本研究首先基于潮霉素B抗性和绿色荧光蛋白表达效率，评估了八种不同基因型的野生和栽培单核菌株。鉴定出三种能够稳定表达外源基因的菌株，通过PEG介导的原生质体转化，其转化效率达到20.0–66.7%。随后，构建了一个整合七种关键元件以增强编辑效率的CRISPR/Cas9系统，并以ura3基因为测试靶点，应用于这三种菌株。基因编辑效率在不同基因型间差异显著，范围在14.3%至75.0%之间，证实了该系统的高效性和基因型依赖性。重要的是，为严格评估所建立转化平台的稳健性和通用性，我们在表现最佳的菌株CCMJ1500101中，通过成功编辑五个与生长、发育和代谢相关的功能基因，进一步验证了其广泛适用性。值得注意的是，在灵芝编辑转化子中首次检测到基因倒位事件，为理解该物种的非同源末端连接修复机制提供了新线索。本研究为四川灵芝建立了一个稳健的双sgRNA CRISPR/Cas9平台，并为未来的基因功能研究和遗传改良提供了宝贵的菌株资源。
引言
四川灵芝属于担子菌门多孔菌目。尽管其具有食用价值和多样的药用活性，但其基因功能分析和遗传改良研究却严重滞后。这些延迟主要源于诸如异核体特性以及与现有基因编辑系统兼容性差等挑战。RNA干扰技术曾作为研究灵芝属基因功能的主要方法，但其通常仅导致靶基因的部分下调而非完全敲除，可能导致基因功能表征不完全。CRISPR/Cas9是一种新型靶向基因编辑技术，具有操作简单、精度高、成本低等优点。一个有效的基因编辑系统需要高效兼容的宿主、优化的载体、增强的启动子和改善的sgRNA稳定性。此前研究已在灵芝中成功应用CRISPR/Cas9系统，并发现物种特异性密码子使用、核定位信号引入、gpd内含子使用等策略对提高编辑效率至关重要。持续表达Cas9以及使用双sgRNA策略也能提高编辑效率。然而，灵芝的遗传操作长期面临挑战，主要因为其每个相连的菌丝细胞含有两个具有不同遗传成分的细胞核，这可能会降低编辑效率。单核菌株被认为更适合作为基因编辑的有效受体。尽管已有研究使用不同的灵芝菌株进行基因编辑，并报告了编辑效率的显著差异，但迄今为止，尚未有研究基于基因型系统筛选灵芝的单核受体菌株，以鉴定那些最适合基因编辑的菌株，特别是对于采用携带七种关键元件的表达载体的双sgRNA体内基因组编辑系统。
材料与方法
本研究选用了八种四川灵芝单核菌株。菌株在麦芽酵母葡萄糖培养基中于28°C黑暗条件下培养。通过在不同浓度潮霉素B的培养基上培养菌丝体，筛选各菌株的潮霉素B致死浓度。构建了以绿色荧光蛋白基因为靶标的灵芝表达载体，用于评估菌株的外源基因表达能力。通过PEG介导的原生质体转化法将构建的CRISPR/Cas9基因编辑载体导入宿主细胞。该编辑载体整合了七种关键元件，包括由Pgpd启动子驱动的密码子优化的Cas9基因、上游引入的内含子、两端的核定位信号序列、由U6启动子驱动的sgRNA表达、HDV核酶元件和SUP4终止子，以增强编辑效率。转化后，通过抗生素抗性筛选和绿色荧光信号检测初步确认转化子，并通过PCR扩增和测序验证基因编辑事件。编辑效率通过分析至少50个随机选择的转化子进行计算。对于ura3基因缺失突变体，通过在PDA培养基和补充尿嘧啶的PDA培养基上培养，观察其菌丝生长差异进行表型分析。
结果
潮霉素B致死浓度评估
对八种灵芝单核菌株的潮霉素B抑制测定显示，其完全抑制浓度范围在50至200 mg/L之间。菌株间表现出高度的遗传多样性，甚至来自同一双核体的单核菌株也显示出有效的敏感性差异。只有对潮霉素B敏感至中度敏感的菌株适合进行遗传转化。
遗传转化灵芝菌株的筛选
使用潮霉素B抗性和绿色荧光作为选择标记，筛选转化子。八种测试菌株的转化效率差异显著。三种菌株产生了同时具有增加的潮霉素B抗性和强绿色荧光信号的PCR阳性转化子，其阳性频率分别为20.0%、62.5%和66.7%。其他一些菌株的转化子则出现GFP不表达或抗性不稳定的情况。基于这些结果，选择CCMJ1500101、CCMJ1507802和CCMJ1509001这三种转化率高的菌株进行后续基因编辑实验。
CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建
以ura3基因作为编辑靶点验证基因编辑系统。将构建好的Cas9-sgRNA表达载体通过PEG介导的原生质体转化成功导入宿主细胞。经过潮霉素B筛选和PCR验证，在菌株CCMJ1500101中成功实现了ura3基因位点697-bp的预期缺失，编辑效率计算为75.0%。表型测定显示，突变体只能在补充尿苷和腺嘌呤的PDA培养基上生长，而在基本培养基上不能生长，验证了ura3基因的成功敲除。
CRISPR/Cas9基因编辑系统在其他灵芝菌株中的应用
在野生菌株CCMJ1509001和栽培菌株CCMJ1507802中应用相同的编辑系统，PCR分析验证了ura3编辑的成功，效率分别为54.6%和14.3%，表明编辑系统适用于不同的遗传背景，但其效率存在显著的菌株依赖性变异。有趣的是，在阳性转化子中首次观察到了基因倒位现象。
CRISPR/Cas9基因编辑系统在其他基因中的应用
为了进一步验证该编辑系统在四川灵芝中的适用性，选择了属于CYP5359家族的三个细胞色素P450基因作为靶点。测序验证显示，对于GsCYP5359E2基因，检测到预期的201-bp缺失；对于GsCYP5359C1基因，则在sgRNA2位点插入了32-bp的片段；对于CYP5359AA1基因上游区域，检测到预期的257-bp缺失和序列倒位两种编辑类型。此外，还成功编辑了交配型调控基因Gshd1和Gshd2。对于Gshd1，部分转化子出现107-bp的缺失导致移码突变，另一些则出现局部序列倒位；对于Gshd2，所有转化子均携带一致的160-bp移码缺失。
讨论
转化效率可能因不同基因型而异，受体的基因型是一个难以通过优化外部因素来克服的关键因素。四川灵芝具有高度的遗传多样性，且其异核特性使基因编辑复杂化。本研究通过筛选八种不同基因型的单核菌株，建立了一个全面的遗传转化系统，并揭示了不同单核菌株在外源基因稳定遗传和表达活性方面存在显著差异。通过整合多种关键元件，成功建立了一个高效、广谱的双sgRNA体内转录基因编辑系统。编辑效率在野生菌株中高于栽培菌株，表明遗传背景的显著影响。本研究将CRISPR/Cas9的应用扩展到灵芝酸生物合成相关的细胞色素P450基因和重要的交配型基因，为后续功能验证提供了宝贵材料。除了常见的插入和缺失，本研究还观察到一种新现象：基因片段倒位。这为了解担子菌中主要的DNA双链断裂修复途径——非同源末端连接修复机制提供了新的见解，特别是关于自然发生的倒位在基因组进化中的作用。
结论
本研究成功在重要的大型真菌四川灵芝中建立了CRISPR/Cas9基因编辑系统。结果清楚地表明，基因编辑效率在不同单核菌株间存在差异。尽管仍需努力进一步提高编辑效率，但本研究产生的基因组编辑突变体为未来的研究提供了宝贵的资源和基础材料，这些研究包括功能基因表征以及对四川灵芝生长、发育和萜类生物合成背后的分子和遗传机制的探讨。
