《Journal of Molecular Cell Biology》：Screening the composition of tubulin isotypes reveals the most abundant TUBB4B for ciliary polarity in ependymal cells
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本研究针对纤毛中微管蛋白异型组成不清的问题，通过CRISPR/Cas9系统对内源性微管蛋白进行标记，发现TUBB4B是纤毛中最丰富的β-微管蛋白异型，并受FOXJ1特异性调控。TUBB4B缺失会破坏脑室管膜细胞的平面细胞极性，导致脑脊液流动障碍和脑积水，为微管蛋白异型在纤毛功能中的特异性作用提供了新见解。
在我们的大脑中，脑脊液如同一条隐秘的河流，滋养着神经细胞并清除代谢废物。这条河流的流动依赖于脑室内壁上一群特殊细胞——脑室管膜细胞（EPCs）的纤毛有节律的摆动。这些纤毛是由微管蛋白组装而成的细胞器，而微管蛋白存在多种异型，如同不同材质的积木。然而，科学家们一直不清楚这些"积木"究竟如何组合才能构建出功能正常的纤毛，以及不同异型是否在纤毛中扮演特定角色。
为了解决这一难题，中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所的研究团队在《Journal of Molecular Cell Biology》上发表了一项突破性研究。他们发现β-微管蛋白异型TUBB4B是脑室管膜细胞纤毛中最丰富的成员，并揭示了它在维持纤毛极性、保证脑脊液正常流动中的关键作用。
研究人员采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对内源性微管蛋白进行标记，结合免疫荧光染色、荧光报告基因实验、染色质免疫沉淀等技术，利用条件性基因敲除小鼠模型，通过活细胞成像、免疫印迹、定量PCR等方法开展了系统研究。
三α-微管蛋白和四β-微管蛋白异型定位于培养EPCs的纤毛中
由于大多数微管蛋白异型缺乏特异性抗体，研究团队创新性地使用CRISPR/Cas9系统给内源性α-微管蛋白和β-微管蛋白异型分别添加HA或GFP标签。结果显示，TUBA1A、TUBA1B、TUBA1C三种α-微管蛋白和TUBB2A、TUBB2B、TUBB4B、TUBB5四种β-微管蛋白异型定位于EPCs纤毛中，其中TUBB4B表达量最高。单细胞RNA测序数据进一步验证了TUBB4B是EPCs中最丰富的β-微管蛋白异型。
所有微管蛋白异型均能定位到小鼠EPCs的纤毛中
为了检验纤毛是否对特定微管蛋白异型有选择性，研究人员通过外源表达所有小鼠微管蛋白异型。结果表明，只要在细胞中表达，所有α-和β-微管蛋白异型都能进入纤毛。通过CRISPR/Cas9策略将TUBA4A和TUBB3分别在内源性Tubala和Tubb4b启动子驱动下表达，发现它们也能参与纤毛组装，说明微管蛋白异型进入纤毛主要取决于其在细胞质中的表达水平。
EPCs中TUBB4B的高表达受FOXJ1促进
研究人员构建了TUBB4B-HA基因敲入小鼠，发现TUBB4B在睾丸、V-SVZ（脑室室管膜下区）和肺等有鞭毛或运动纤毛的组织中高表达。在EPCs多纤毛形成过程中，TUBB4B在蛋白和mRNA水平均上调。通过siRNA敲低Foxj1发现，Tubb4b表达显著降低，而其他微管蛋白异型基本不受影响。荧光报告基因和染色质免疫沉淀实验证实FOXJ1直接结合在Tubb4b启动子区（-925bp至-600bp），特异性调控其转录。
TUBB4B缺陷小鼠出现进行性脑积水
研究团队通过将Tubb4bflox/flox小鼠与Nestin-Cre小鼠交配，获得了在EPCs前体细胞中特异性敲除TUBB4B的条件性基因敲除（cKO）小鼠。纯合TUBB4B cKO小鼠出生后出现生长迟缓、圆顶形头颅等表型，超过一半在出生后50天内死亡。脑切片显示纯合cKO小鼠脑室严重扩张，即脑积水。
TUBB4B缺陷破坏跨室管膜组织的定向纤毛搏动
尽管TUBB4B缺失不影响纤毛发生率和搏动频率，但破坏了相邻EPCs间纤毛搏动方向的协调性。荧光微珠追踪实验显示，在纯合cKO小鼠中，微珠仅局部振荡或旋转，而非像对照组那样单向流动。进一步研究发现，TUBB4B缺失破坏了基底体的平移极性（从细胞中心到基底体簇中心的位移距离缩短）和旋转极性（基底体方向紊乱），导致纤毛搏动无方向性。
该研究首次系统揭示了脑室管膜细胞运动纤毛中微管蛋白异型的组成，发现TUBB4B是最丰富的β-微管蛋白异型，并受纤毛发生转录因子FOXJ1特异性调控。研究证明TUBB4B通过维持基底体的平移极性和旋转极性，确保纤毛协调搏动和脑脊液定向流动。TUBB4B缺失导致平面细胞极性破坏，是脑积水发生的重要机制。
这项研究不仅深化了对微管蛋白异型在纤毛中功能特异性的理解，也为相关纤毛疾病的治疗提供了新的潜在靶点。研究建立的内源性微管蛋白标记策略为后续研究微管蛋白异型的精细功能奠定了基础。
