《Molecular Cell》：RNA-coupled CRISPR screens reveal ZNF207 as a regulator of LMNA aberrant splicing in progeria
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本研究针对大多数选择性剪接事件的调控机制尚不明确的难题，开发了CRASP-seq（基于CRISPR的表型测序鉴定选择性剪接调控因子）技术平台。研究人员利用该技术系统性识别调控因子，并以早衰症（HGPS）相关的LMNA基因隐性剪接位点异常激活为概念验证，发现并证实了锌指蛋白ZNF207通过直接结合U1 snRNP（小核核糖核蛋白）核心组分，广泛调控选择性剪接的关键作用。ZNF207的耗竭可纠正患者细胞中LMNA的异常剪接并降低早衰蛋白（progerin）水平。该研究不仅揭示了ZNF207作为U1 snRNP辅助因子的新功能，也彰显了CRASP-seq技术在揭示剪接调控关键节点方面的强大能力。
在生命科学的精密调控网络中，前体信使RNA（pre-mRNA）的剪接是决定基因表达准确性和多样性的核心环节。通过这一过程，单个基因能够产生多种不同的mRNA亚型，从而极大地扩展了蛋白质组的复杂性和细胞的功能可塑性。然而，这种灵活性也带来了潜在的脆弱性——剪接过程的失调与众多人类疾病密切相关，从癌症到神经退行性疾病，乃至罕见的遗传病。其中，霍奇金-吉尔福德早衰综合征（Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome, HGPS）是一个令人心痛的例证。患者因LMNA基因的一个隐性5‘剪接位点被激活，产生一种称为progerin的截短型 lamin A蛋白，导致核纤层结构和表观遗传调控严重破坏，通常在青少年时期便因心血管并发症而夭折。尽管部分疾病相关的剪接事件已被识别，但调控这些事件的关键因子和分子通路在很大程度上仍是未知的，这主要源于缺乏能够定量、高通量评估剪接调控的高效方法。
为了攻克这一技术瓶颈，并深入探索剪接调控的奥秘，由Amit K. Behera等人领导的研究团队在《Molecular Cell》上发表了他们的最新成果。他们开发了一种名为CRASP-seq（CRISPR-based identification of regulators of alternative splicing with phenotypic sequencing）的革命性技术平台。该平台将混合CRISPR基因扰动与剪接报告基因的深度测序相结合，能够从单一的RNA样本中，定量评估几乎所有人类蛋白质编码基因对特定选择性剪接事件的影响。研究人员利用这一强大工具，不仅验证了已知的剪接调控因子，更发现了大量未曾被报道的新调控因子。作为概念验证，他们聚焦于早衰症中LMNA的异常剪接事件，成功鉴定出ZNF207（一个此前主要已知参与有丝分裂纺锤体组装的蛋白）是progerin亚型产生的关键正调控因子。后续机制研究表明，ZNF207通过其锌指结构域（ZnF）直接与U1 snRNP（小核核糖核蛋白）组分相互作用，从而广泛地调控选择性剪接。这项研究不仅将ZNF207定位为一个重要的剪接调控因子，也展示了CRASP-seq在系统性揭示剪接调控网络中的巨大潜力。
研究人员为开展此项研究，主要运用了几个关键技术方法：首先是核心的CRASP-seq技术平台，该平台整合了基于CHyMErA（Cas杂交用于多重编辑和应用筛选）系统的全基因组CRISPR基因敲除文库与可诱导表达的剪接报告基因 minigene（微型基因），并通过高通量测序将指导RNA（hgRNA）与特定的剪接结果（以PSI，即百分数剪接纳入值量化）进行关联。其次，研究采用了TurboID邻近标记技术结合质谱分析，以鉴定ZNF207的蛋白相互作用组。第三，通过增强型紫外交联免疫沉淀测序（eCLIP-seq）技术，绘制了ZNF207在全转录组范围内的RNA结合图谱。第四，利用碱基编辑器（Base Editor）介导的高通量突变扫描技术，对ZNF207等基因进行了关键功能域和残基的鉴定。此外，研究还运用了RNA干扰（RNAi）、体外剪接实验、蛋白质免疫共沉淀（Co-IP）以及蛋白质重组与体外结合实验等多种分子和生化手段进行机制验证。研究所用的细胞模型包括HAP1、RPE1、HEK293T等细胞系，以及来自HGPS患者的永生化成纤维细胞。
Establishing a robust screening platform for quantifying splicing regulation
研究人员成功开发了CRASP-seq这一可扩展的定量平台。该平台的核心是将微型基因（minigene）报告系统整合到全基因组 lentiviral（慢病毒）CRISPR基因敲除文库中。他们构建了一个包含95,893条杂交指导RNA（hgRNA）的文库，靶向18,888个人类蛋白质编码基因。报告基因的表达由多西环素（Doxycycline）诱导的TRE（四环素反应元件）启动子控制。通过优化实验流程（例如选择转导后4天作为报告基因诱导时间点，并修复载体中可导致 nonsense-mediated decay（NMD，无义介导的mRNA降解）的隐性剪接位点），研究人员确保了筛选的灵敏度和可靠性。初步应用在对FAS和EZH2基因已知剪接事件的筛选中，成功鉴定出大量富含RNA剪接相关功能的调控因子，验证了该平台的有效性。
Application of CRASP-seq to disease-relevant splicing events
为了评估CRASP-seq的普适性，研究人员将其应用于另外三种疾病相关的剪接事件：PKM基因中决定代谢通路差异的第9/10号互斥外显子、SRSF7基因中引入提前终止密码子并触发NMD的“毒害”外显子（poison exon）、以及野生型（WT）和含早衰症致病突变（1824C>T）的LMNA外显子11剪接报告基因。在所有五个独立的筛选中（FAS, EZH2, PKM, SRSF7, LMNA），CRASP-seq均成功识别出已知的调控因子（如SRSF3、HNRNPA1对PKM的调控），并发现了许多新的调控关系（如RBM39对PKM和EZH2剪接的调控）。综合分析这五个筛选结果，共鉴定出370个选择性剪接调控因子，它们显著富集于RNA剪接和代谢相关通路。不同剪接事件的扰动效应相关性分析还揭示了剪接体各组分之间的功能关联簇。
ZNF207 regulates LMNA aberrant splicing in progeria
在对LMNA突变报告基因的筛选中，研究人员发现多个基因可以调控其剪接，其中ZNF207的敲除能显著纠正突变导致的异常剪接，促进 canonical（规范）LMNA亚型的产生，而在野生型LMNA报告中未观察到促progerin表达的效应。ZNF207此前主要被研究作为有丝分裂检查点蛋白，与BUB3相互作用。研究人员通过siRNA（小干扰RNA）在表达LMNA报告基因的HEK293T细胞和HGPS患者来源的成纤维细胞中验证了ZNF207的功能，证实其敲低能有效恢复内源性LMNA的正常剪接，并显著降低progerin的蛋白水平。通过表达siRNA抵抗的ZNF207开放阅读框（ORF）可以部分回救上述表型，证明了作用的特异性。
ZNF207 depletion results in widespread alternative splicing changes
为了探究ZNF207的全局性功能，研究人员在HEK293T细胞中敲低ZNF207并进行RNA测序（RNA-seq）。分析结果显示，ZNF207的缺失导致数千个剪接事件发生改变，主要是外显子跳跃（cassette exon skipping）。通过在Flp-In细胞系中表达siRNA抵抗的C端FLAG标签的ZNF207，可以回救大部分剪接变化，从而定义了800多个受ZNF207调控的剪接事件。转录组分析发现，ZNF207敲低引起的基因表达变化大多与由剪接变化触发的NMD有关，而非直接调控剪接因子转录所致。此外，ZNF207的剪接调控功能不依赖于其有丝分裂伙伴BUB3。重要的是，在体外剪接实验中，使用特异性抗体耗竭HeLa细胞核提取物中的ZNF207，同样能增加规范LMNA剪接，减少progerin亚型的形成，表明ZNF207直接参与剪接调控。
ZNF207 binds regulated exons and associates with the splicing machinery
为了阐明ZNF207的调控机制，研究人员利用TurboID邻近标记技术和质谱分析，鉴定出187个ZNF207的邻近相互作用蛋白，其中显著富集了包括U1、U2、U4/U6.U5 snRNP（小核核糖核蛋白）在内的多种剪接体成分和辅助调控因子。免疫共沉淀实验进一步证实ZNF207能以RNA非依赖的方式与U1 snRNP组分（如SNRPA/U1-A, SNRNP70/U1-70K）、U2组分SF3B1、U5组分SNRNP200等相互作用。通过eCLIP-seq技术，研究人员发现ZNF207（仅限有剪接活性的C端FLAG标签形式）优先结合于受其调控的外显子编码区，提示其结合可能直接参与剪接调控。
CRASP-seq coupled to high-throughput mutagenesis identifies key regions of ZNF207 for splicing regulation
为了精细定位ZNF207蛋白中负责剪接调控的关键区域，研究人员将CRASP-seq平台与高通量tiling（平铺）突变扫描技术相结合。他们将CHyMErA敲除文库替换为靶向ZNF207等39个基因的碱基编辑器tiling文库。筛选结果显示，靶向ZNF207锌指结构域（ZnF）的引导RNA（sgRNA）对纠正LMNA异常剪接的效果最为显著。通过构建一系列ZNF207截短突变体和点突变体进行功能回救实验，研究人员证实ZnF结构域，特别是第二个ZnF结构域中的K42残基，对于ZNF207的剪接调控活性至关重要。K42带正电荷的特性（K42R可回救功能而K42E和K42M不能）暗示其可能通过静电相互作用与核酸结合。进一步实验表明，包含ZnF结构域及其相邻螺旋区域（氨基酸1-122）的截短体已具备大部分剪接调控功能。
ZNF207 engages in critical interactions with U1 snRNP
深入的机制研究表明，ZNF207的ZnF结构域，特别是K42残基，是其与U1 snRNP相互作用所必需的。点突变K42E会破坏ZNF207与U1 snRNP组分（U1-A, U1-C, U1-70K）的结合，而不影响其与U2组分SF3B1的相互作用。RNA免疫沉淀证实ZnF结构域能结合U1 snRNA（小核RNA）。体外pull-down（下拉）实验和电泳迁移率变动分析（EMSA）进一步揭示，ZNF207通过其ZnF结构域直接结合U1-70K蛋白和U1 snRNA，并且这种结合是ZnF依赖性的，K42E突变会削弱ZnF+Hel截短体与U1 snRNP的结合。这些结果共同表明，ZNF207通过其ZnF结构域与U1 snRNP形成关键相互作用，从而调控剪接。
综上所述，本研究成功开发了CRASP-seq这一强大的功能性基因组学平台，用于系统性鉴定选择性剪接的调控因子和关键功能域。应用该技术，研究团队揭示了ZNF207这一此前与剪接关联不大的蛋白质，实际上是通过直接与U1 snRNP相互作用来广泛调控选择性剪接的关键因子。在早衰症背景下，ZNF207正向调控导致疾病的LMNA异常剪接事件，其功能缺失能有效纠正剪接错误并降低毒性progerin蛋白水平。这一发现不仅为理解早衰症的分子病理提供了新视角，也提示ZNF207可能成为潜在的治疗干预靶点。更重要的是，该研究凸显了核心剪接体成分及其辅助因子在特定剪接事件调控中的选择性作用，挑战了以往认为它们仅提供基础剪接功能的观点。CRASP-seq技术的建立，为未来在更广泛生物学过程和疾病模型中解密复杂的剪接调控网络奠定了方法学基础，有望催生更多关于RNA processing（RNA加工）调控机制的重大发现。
