《Metabolic Engineering》：Industrial-scale production of Lacto-N-tetraose in engineered
Bacillus subtilis via modular pathway optimization
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本研究针对利用安全微生物底盘高效合成重要母乳寡糖Lacto-N-tetraose (LNT)的工业需求，通过系统酶筛选、代谢工程改造及CRISPRi动态调控，在GRAS认证的枯草芽孢杆菌中构建了高效LNT合成途径。最终工程菌株在5-L发酵罐中产量达80.48 g/L，转化率优异，为母乳寡糖的食品安全级生物制造提供了创新性解决方案。
在婴幼儿营养领域，母乳被视为“黄金标准”，其中母乳寡糖（Human Milk Oligosaccharides, HMOs）作为第三大固体成分，对婴儿的健康发育起着至关重要的作用。Lacto-N-tetraose（LNT，乳糖-N-四糖）是其中一种含量丰富且结构核心的HMO，具有调节肠道菌群、抑制病原体吸附和免疫调节等多种生理功能。随着美国FDA授予其GRAS（Generally Recognized as Safe，公认安全）地位，LNT已被批准添加到婴幼儿配方奶粉中，市场需求巨大。
然而，LNT的商业化生产面临挑战。化学合成步骤繁琐且成本高昂，而从母乳中直接提取则产量极低，无法满足工业需求。因此，利用微生物细胞工厂进行生物合成成为最有前景的替代方案。目前的研究几乎全部集中于使用大肠杆菌作为生产宿主，虽然产量可观，但大肠杆菌内毒素的存在为其在食品和医药领域的应用带来了安全隐患。相比之下，枯草芽孢杆菌具有GRAS认证，是生产食品级产品的理想底盘微生物。此前，已有研究成功利用枯草芽孢杆菌生产了2‘-岩藻糖基乳糖（2’-FL）、乳糖-N-新四糖（LNnT）等HMOs，但LNT在枯草芽孢杆菌中的从头生物合成尚未见报道。因此，开发一种基于枯草芽孢杆菌的安全、高效LNT生物制造平台，对于满足日益严格的食品安全要求和推动HMOs的产业化具有重大意义。这项发表于《Metabolic Engineering》的研究，正是为了攻克这一难题。
为实现在枯草芽孢杆菌中高效生产LNT，研究人员综合运用了多种先进的合成生物学与代谢工程技术。首先，通过系统的异源酶筛选，确定了来自Pseudogulbenkiania ferrooxidans的β-1,3-半乳糖基转移酶（Pf-β-1,3-GalT）和来自Neisseria polysaccharea的β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶（NpLgtA）为最优催化组合，并选用大肠杆菌的LacY作为乳糖转运蛋白，成功在枯草芽孢杆菌中构建了基础的LNT合成途径。其次，利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术，敲除了与LNT合成竞争碳流的多条代谢途径（如胞外多糖合成通路基因epsA-O、乳糖代谢相关基因等），并过表达了前体供应通路的关键基因（如glmS, glmM, galE），以强化UDP-GlcNAc和UDP-Gal的供应。尤为关键的是，研究团队开发了一套经济高效的CRISPR干扰（CRISPRi）系统，用于动态下调生长必需但与前体合成竞争的基因（如磷酸戊糖途径关键酶基因zwf、糖酵解途径基因pfkA、肽聚糖合成基因murAB），实现了碳流从细胞生长向LNT合成的高效重定向。此外，还通过培养基优化（如碳氮源调整）和发酵工艺控制（如5-L罐补料分批发酵），显著提升了LNT的产量和转化效率。
3.1. LNT生物合成途径在枯草芽孢杆菌中的模块化组装
研究人员首先通过异源表达来自不同微生物的糖基转移酶和转运蛋白，在枯草芽孢杆菌中从头构建LNT合成途径。经过详细的功能筛选，发现来自P. ferrooxidans的Pf-β-1,3-GalT和来自N. polysaccharea的NpLgtA的组合（工程菌株BPPY）效果最佳，在摇瓶培养中可产生1.42 g/L的LNT，证明了在枯草芽孢杆菌中实现LNT完整生物合成的可行性。同时，也评估了枯草芽孢杆菌内源转运蛋白LicC的功能，但其效率不及大肠杆菌的LacY。
3.2. 异源基因表达模式选择（诱导型 vs. 组成型）
研究人员比较了诱导型启动子Pgrac（需要IPTG诱导）和组成型强启动子P43对LNT合成的影响。结果表明，使用诱导型启动子并在培养3.5小时后进行诱导的策略（菌株BPPY）优于组成型表达（菌株BP43PPY），能将LNT产量提高至1.56 g/L。这说明动态控制基因表达时序对于协调细胞生长与产物合成至关重要。
3.3. 竞争代谢途径的消除
为了将更多的代谢流导向LNT及其前体合成，研究团队利用CRISPR-Cas9技术敲除了一系列竞争途径的基因，包括负责胞外多糖合成的epsA-O基因簇、多个可能代谢乳糖的基因（如ganB, ganA等）以及消耗UDP-糖前体的基因（如nagBA）。组合敲除这些基因的工程菌株BPPY19，其LNT产量提升至1.85 g/L，表明减少代谢分流能有效提高目标产物得率。
3.4. UDP-GlcNAc和UDP-Gal供应途径的增强
LNT的合成严重依赖两种关键核苷酸糖前体：UDP-GlcNAc和UDP-Gal。研究人员通过多种策略强化其供应：一是通过核酶工程（如插入组成型启动子Pc2up和终止子Tbpr）来解除GlmS核酶的反馒抑制，增强UDP-GlcNAc合成途径的通量；二是分别过表达前体合成通路中的关键基因，如glmM（催化GlcN6P向GlcN1P的转化）和galE（参与UDP-Gal的合成）。将最优策略组合后得到的菌株BPPY29，LNT产量进一步提高到2.27 g/L。
3.5. 异源途径容量的放大
为了克服异源酶表达可能存在的瓶颈，研究人员将LNT合成途径的关键酶基因（pf-β-1,3-galT, NPlgtA, lacY）以多拷贝形式整合到菌株BPPY29的基因组lytC位点，构建了菌株BPPY31。虽然该菌株的生物量有所下降，但LNT产量提升至2.49 g/L，比生产率提高了73%，证明增强异源途径的表达能有效提升合成效率。
3.6. 异源转运蛋白CmSET对寡糖的底物特异性外排
尝试引入来自Chania multitudinisentens的推测寡糖转运蛋白CmSET以促进LNT外排，但意外发现工程菌株BPPY32的LNT产量大幅下降，而中间产物LNTri II大量积累。这表明CmSET可能优先转运LNTri II而非LNT，提示转运蛋白的底物特异性在代谢工程中需要仔细评估。
3.7. 促进LNT生物合成的营养优化
研究人员发现，基础培养基MC1可能限制了高代谢负荷工程菌的生长和合成能力。通过优化碳源（提高葡萄糖浓度）、氮源等成分，开发了新的培养基MC2。在此培养基中，核心工程菌株BPPY31的LNT产量飙升至7.83 g/L，生物量（OD600）达到33.54，充分证明了营养优化对释放工程菌潜力的重要性。
3.8. 经济高效的CRISPRi平台的开发
为了解决竞争途径基因因对细胞生长至关重要而无法直接敲除的问题，研究团队开发了一套简化、低成本的CRISPRi系统。该系统包含一个木糖诱导的dCas9表达盒和一个可灵活组装单重或多重sgRNA的载体，能够实现对目标基因转录水平的精准下调。
3.9. 中心碳代谢的动态CRISPRi调控
将CRISPRi系统导入高产菌株BPPY31后，研究人员系统地靶向了磷酸戊糖途径（HMP）的zwf、糖酵解途径（EMP）的pfkA以及肽聚糖合成的murAB等关键基因。通过筛选不同靶位的sgRNA，实现了对这些基因表达程度的梯度抑制。最终，结合对zwf、pfkA和murAB的三重抑制，构建了工程菌株BD7。该菌株在摇瓶中将LNT产量提高到12.51 g/L，碳转化效率达到17.62%。
3.10. 5 L生物反应器中LNT的规模化生产
最后，在5-L生物反应器中对最优菌株BD7进行补料分批发酵验证。通过精确控制葡萄糖和乳糖的流加、以及诱导时机，工程菌株在72小时内LNT产量达到创纪录的80.48 g/L，副产物LNTri II仅为4.43 g/L，乳糖向LNT的转化率高达92.25%，展示了该平台强大的工业化应用潜力。
本研究成功在GRAS认证的枯草芽孢杆菌中建立了高效的LNT从头生物合成平台。通过模块化的途径工程策略——包括关键酶元件的筛选与优化、竞争途径的消除与调控、前体供应途径的强化以及发酵工艺的优化——逐步将LNT产量从最初的1.42 g/L提升至摇瓶水平的12.51 g/L，并最终在5-L发酵罐中实现了80.48 g/L的高产。这项研究的重要意义在于：首先，它首次在枯草芽孢杆菌中实现了LNT的完整生物合成，为HMOs的食品安全级生产提供了优于大肠杆菌的替代方案，规避了内毒素风险。其次，研究中所开发的低成本、高效率CRISPRi系统为在枯草芽孢杆菌乃至其他工业微生物中进行复杂的代谢调控提供了强大的通用工具。最后，该工作所达到的LNT滴度是目前已报道的最高水平，证明了所采用代谢工程策略的有效性，标志着向HMOs的工业化生物制造迈出了关键一步。该平台不仅可用于LNT的生产，其策略和工具也有望扩展至其他高价值寡糖和糖复合物的生物制造中，具有广阔的产业应用前景。
