Src激酶通过Stat3-Hif1α信号轴调控Ndrg1表达抑制丙型肝炎病毒颗粒释放的新机制

《Journal of Biological Chemistry》：Unique bifunctional α-sialidase/β- N-acetylgalactosaminidase from Bifidobacterium bifidum acting on the Sda antigen

本研究针对酪氨酸激酶抑制剂（TKI）在HCV感染中作用机制不清的问题，通过筛选临床常用TKI，发现双重Abl/Src激酶抑制剂Bosutinib可显著抑制细胞外HCV病毒滴度。利用CRISPR/Cas9基因敲除技术证实Src激酶缺失通过下调脂代谢调控因子Ndrg1，意外增强HCV颗粒释放，并揭示其经由Stat3-Hif1α信号通路转录调控Ndrg1的分子机制。该研究为HCV宿主互作提供了新视角，对TKI治疗合并HCV感染患者具有临床警示意义。

　　

丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）是一种正链RNA病毒，全球约有5800万人遭受慢性感染，其中近80%会发展为持续性感染，显著增加肝硬化和肝细胞癌（Hepatitis C virus, HCC）的风险。尽管直接抗病毒药物（Direct-acting antivirals, DAA）的出现极大地改善了丙型肝炎的治疗效果，但耐药病毒的出现、消除病毒后肝癌风险持续等新问题依然严峻。尤其值得关注的是，随着酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors, TKI）在肿瘤治疗中的广泛应用，明确TKI对HCV生命周期的影响，对于合并HCV感染的肿瘤患者治疗方案的选择具有重要的指导意义。

在此背景下，研究人员在《Journal of Biological Chemistry》上发表论文，系统评估了多种临床批准TKI对HCV增殖的影响。他们意外地发现，双重抑制Abl和Src激酶的Bosutinib能显著降低细胞外HCV病毒滴度。为了深入解析这一现象背后的机制，研究团队运用了多种关键技术方法：包括细胞培养衍生HCV（HCVcc）感染模型、CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术（用于构建Src、Abl、Stat3基因敲除细胞系）、小干扰RNA（siRNA）介导的基因沉默、微阵列转录组分析、免疫印迹（Immunoblotting）、免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation）、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）以及半数组织培养感染剂量（TCID₅₀）测定等。

功能性筛选酪氨酸激酶抑制剂揭示其对HCV滴度的差异化影响

通过筛选一系列TKI，研究人员发现Bosutinib能显著抑制细胞外HCV感染性病毒颗粒的产量，而两种Syk激酶抑制剂则表现出相反的效果。进一步检测表明，Bosutinib处理降低了细胞外HCV RNA水平，但对细胞内病毒滴度无显著影响，提示其作用环节可能发生在病毒复制之后，即病毒的释放阶段。

酪氨酸激酶抑制剂处理不影响HCV进入或病毒复制

免疫荧光染色、RT-qPCR和免疫印迹分析结果一致表明，Bosutinib及两种Syk抑制剂处理并未影响HCV的进入效率、细胞内RNA复制或病毒蛋白（如NS3和核心蛋白）的合成，进一步将TKI的作用定位于病毒生命周期的后期阶段。

转录组学改变的综合分析揭示调控HCV释放的候选基因和通路

对Bosutinib处理的HCV感染细胞进行微阵列分析，鉴定出927个差异表达基因。基因本体富集分析显示，脂肪酸代谢过程、类固醇代谢过程等通路显著富集，这些通路与病毒释放密切相关。

Src激酶作为HCV颗粒释放的负调控因子发挥作用

为了区分Bosutinib的双重抑制作用，研究团队构建了Src基因敲除（Src-KO）细胞系。出乎意料的是，Src的缺失并未影响病毒的复制、蛋白合成或细胞内病毒滴度，但却显著增强了感染性病毒颗粒的释放以及细胞外HCV RNA水平。这表明Src激酶在HCV生命周期的晚期起到了限制性作用。

Ndrg1负向调控HCV颗粒释放

转录组数据提示，脂代谢相关因子Ndrg1在Bosutinib处理后表达下调。研究人员通过siRNA敲低Ndrg1，发现其同样能促进HCV颗粒的释放，而不影响病毒复制，证实Ndrg1是病毒释放的负调控因子。

Src激酶通过下调Ndrg1调控HCV颗粒释放

后续实验证实，Abl激酶的敲除并不影响Ndrg1表达，而Src的敲除则显著降低了Ndrg1在mRNA和蛋白水平的表达。在Src-KO细胞中过表达Ndrg1，可以逆转其增强病毒释放的表型，明确了Src-Ndrg1轴在调控HCV释放中的因果关系。

Src激酶通过Stat3-Hif1α信号通路调控Ndrg1转录

机制探索表明，Src激酶并不通过改变Hif1α蛋白丰度来调控Ndrg1，而是通过磷酸化Stat3的Tyr705位点，促进Stat3与Hif1α的相互作用，从而协同激活Ndrg1的转录。在Stat3敲除细胞中，Hif1α稳定剂CoCl₂也无法诱导Ndrg1的上调，证实了Stat3在Hif1α转录活性中的必要性。

本研究揭示了一个全新的宿主-病毒调控轴：Src激酶通过Stat3-Hif1α信号通路转录调控Ndrg1的表达，进而负向调控HCV病毒颗粒的释放。这一发现不仅深化了对HCV生命周期晚期，特别是病毒释放阶段宿主因子调控机制的理解，更重要的是，对临床使用TKI（如Bosutinib）治疗合并HCV感染的肿瘤患者提供了重要的理论参考。研究提示，抑制Src激酶可能意外地通过下调Ndrg1而促进病毒释放，这在制定治疗方案时需要慎重考虑。该工作为开发针对宿主因子的新型抗病毒策略以及优化现有TKI临床应用开辟了新的视角。