《LWT》：Tandem crRNA array-mediated Cas12a platform for all-in-one multiplex detection of foodborne pathogens
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本研究针对食源性病原体多重检测需求，开发了一种基于串联crRNA阵列的Cas12a平台。通过系统优化双crRNA阵列（靶向大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌），在300–500 nM Cas12a浓度下实现稳定检测，显著降低crRNA和报告探针用量。该平台在35–39°C条件下保持高性能，支持现场应用，并可扩展至八种病原体的一锅法检测，为食品安全监测提供了高效、低成本的多重诊断方案。
食源性病原体引发的食品安全问题日益受到关注，快速、准确地检测多种病原体对公共卫生至关重要。传统的检测方法如培养法和PCR技术虽较为成熟，但通常耗时较长、操作复杂，且难以实现多重同步检测。近年来，CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）技术因其高特异性和程序化操作优势，在分子诊断领域展现出巨大潜力。其中，CRISPR相关蛋白12a（Cas12a）能够在crRNA（CRISPR RNA）引导下识别特定DNA序列，并触发反式切割（trans-cleavage）活性，实现对报告分子的切割和信号放大，为快速检测提供了新工具。然而，现有Cas12a检测多局限于单靶标检测，难以满足实际样本中多种病原体共存场景的需求。尽管已有研究尝试通过混合多个crRNA或物理分隔反应体系实现多重检测，但这些策略常面临试剂消耗大、交叉反应风险高或设备依赖性强等问题。因此，开发一种紧凑、资源高效且易于扩展的多重检测平台成为当前研究的重点。
针对这一挑战，天津市农业科学院的研究团队在《LWT》期刊发表论文，提出了一种基于串联crRNA阵列的Cas12a平台，旨在实现食源性病原体的多重一体化检测。研究通过构建双crRNA阵列（靶向大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌），系统评估了Cas12a浓度、crRNA和报告探针用量、预孵育时间及温度等参数对检测性能的影响，并进一步将阵列扩展至八靶标检测，验证其实际应用潜力。关键技术方法包括：通过体外转录合成单crRNA和串联crRNA阵列；利用重组质粒作为双链DNA激活剂模拟病原体靶标；采用荧光实时监测系统（如CFX96 PCR仪）记录Cas12a的反式切割活性；通过点突变实验和浓度梯度分析评估系统的特异性和定量能力。
3.1. 双crRNA阵列介导的Cas12a系统性能评估
研究首先设计了靶向大肠杆菌O157:H7（crRNA-E）和金黄色葡萄球菌（crRNA-S）的双crRNA阵列（DcrRNA-ES），并发现其在高Cas12a浓度（300–500 nM）下仍保持稳定活性，而单crRNA系统在此条件下信号显著下降。阵列结构还降低了对crRNA和报告探针的需求（分别减少67%和40%），且短暂预孵育（5–10分钟）可使荧光信号提升30%。温度适应性实验表明，系统在35–39°C范围内性能稳健，适合现场应用。
3.1.4. 连接子长度与crRNA位置对阵列性能的影响
通过比较不同长度（0、10、20、30、60 nt）的RNA连接子，研究发现零核苷酸连接子（0-nt）能最大化信号输出，且crRNA在阵列中的顺序影响活性：位于3′端的crRNA信号增强约20–30%，而5′端crRNA活性与单crRNA相当。这种位置效应提示阵列设计需考虑crRNA排列优化。
3.1.6. 特异性与定量性能
针对靶标DNA的PAM（原间隔序列相邻基序）和原型间隔区引入点突变后，双阵列系统与单crRNA系统均能有效区分单碱基错配，且多突变可完全抑制激活。灵敏度实验显示，系统在低浓度范围（<2 nM）内呈线性响应（R2> 0.99），证实其定量检测能力。
3.2. 规模扩展：八重crRNA阵列实现多重检测
研究成功构建了包含八个crRNA单元的阵列（OcrRNA），可同时检测大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌和黄曲霉的特异性基因。尽管阵列中间位置的crRNA信号较强，但增加Cas12a浓度（至800 nM）可平衡各单元活性。在多靶标混合实验中，系统无交叉反应，准确识别所有目标，验证了其高通量检测可靠性。
本研究证实串联crRNA阵列可作为Cas12a多重检测的标准化框架，通过结构优化和参数调整，显著提升检测效率与资源利用率。该平台不仅为食品安全监测提供了可扩展的现场解决方案，还为CRISPR阵列设计中的位置效应、酶负载策略等机制问题提供了新见解。未来研究可进一步探索阵列在复杂样本（如食品基质）中的适用性，并推动其与便携设备集成，实现更广泛的现场诊断应用。
