重磅突破！iPSC 源工程肝细胞片

为解决血友病 B 治疗难题，韩国研究人员开展 iPSC 源工程肝细胞片治疗血友病 B 的研究。结果显示该细胞片能长时间分泌 FIX 蛋白。这一成果为血友病 B 治疗带来新希望，极具科研价值，推荐大家阅读。

　　

血友病 B（Hemophilia B）是一种常见的出血性疾病，每 40000 名男性中就有一人患病，这是由于凝血因子 IX（FIX）缺乏导致的。FIX 基因包含 8 个外显子和 2780bp 的转录本，目前在血友病 B 患者中已发现超过 3656 种突变，这些突变可导致患者出现严重的自发性和复发性关节出血，引发关节炎、畸形等并发症，甚至增加残疾和死亡风险。

目前，血友病 B 患者的治疗面临诸多难题。他们需要频繁接受凝血因子浓缩物治疗，标准半衰期的 FIX 每周需给药 2 - 3 次，延长半衰期的 FIX 每 2 - 3 周给药 1 次。这种频繁的治疗不仅给患者带来沉重的经济负担，还可能引发中和抗体等副作用。而且在发展中国家，由于治疗费用高昂，只有 20% 的全球人口能够负担得起，并且血浆衍生的因子浓缩物存在血源传播的风险。虽然肝细胞移植有治疗血友病 B 的潜力，但供体的可用性严重限制了其应用。因此，寻找一种更有效的治疗方法迫在眉睫。

为了解决这些问题，来自韩国研究人员在《Stem Cell Research & Therapy》期刊上发表了题为 “Engineered factor IX-secreting hepatocyte sheets derived from induced pluripotent stem cells for hemophilia B treatment” 的论文。他们通过一系列研究，成功制备了能够分泌 FIX 的肝细胞样细胞片，为血友病 B 的治疗带来了新的希望。研究表明，这种工程化的 FIX 分泌细胞片在体外和体内都能长时间分泌 FIX 蛋白，相比传统的单细胞注射治疗方式具有明显优势，有望成为临床治疗血友病 B 的有效工具 。

在这项研究中，研究人员用到了几个关键技术方法。首先是基因编辑技术 CRISPR/Cas9，利用它将人 FIX 基因插入到诱导多能干细胞（iPSCs）的 APOC3 位点，使细胞能够分泌 FIX。其次是细胞片技术，通过温度响应性聚合物接枝的细胞培养皿（TRCD），利用温度变化（从 37°C 降至室温）来制备细胞片，这种技术可以提高细胞递送效率，减少对细胞的损伤 。此外，还运用了细胞培养和分化技术，将 iPSCs 诱导分化为肝细胞，并通过多种检测技术对细胞的功能和特性进行评估。

下面我们来看看具体的研究结果：

1. 成功整合人类 FIX 基因到 iPSCs 的 APOC3 位点：研究人员设计了一种 2kb 的载体，通过 CRISPR/Cas9 系统将其整合到 iPSCs 的 APOC3 位点。经过单细胞克隆筛选和测序验证，发现整合的序列没有错配。免疫组化（IHC）和流式细胞术（FACS）分析表明，FIX 分泌的 iPSCs 表达多能性相关标记 OCT4、SOX2、KLF4 和 Nanog，说明载体转染没有改变 iPSCs 的多能性。

2. FIX Ki-iPSCs 增强 FIX 基因表达和蛋白分泌，且不影响肝细胞分化能力：研究人员将 WT-iPSCs 和 FIX KI-iPSCs 逐步分化为确定性内胚层（DE）、肝内胚层（HE）、未成熟肝细胞（IMH）和成熟肝细胞（MH）。在 MH 阶段，两种细胞都呈现出肝细胞样形态，且 qRT-PCR 数据显示它们的肝细胞特异性标记（HNF4a 和 AFP）水平相似，这表明 FIX 基因敲入过程没有改变 iPSCs 的肝细胞分化能力。但 FIX KI-iPSC 组的 FIX 基因表达水平显著高于 WT-iPSC 组，分泌的 FIX 蛋白量更是远超 WT-iPSC 组，这说明 FIX 基因成功敲入 iPSCs 并发挥了作用。

3. 分化的肝细胞样细胞表达功能特征和阶段特异性标记：通过免疫细胞化学（ICC）、qRT-PCR 和吲哚菁绿（ICG）测试，研究人员对分化的肝细胞特征进行评估。ICC 分析显示，分化的肝细胞 iPSC 标记（OCT4 和 SOX2）呈阴性，肝细胞特异性标记（HNF4a 和 AFP）呈阳性。qRT-PCR 分析表明，随着分化阶段的推进，DE、HE、IMH、MH 阶段的标记基因（FOXA2、HNF4a、AFP 和白蛋白）表达水平逐渐增加。ICG 检测发现，分化的肝细胞样细胞具有化学摄取和分泌功能，能够摄取和排泄 ICG 试剂，这表明 FIX KI-iPSCs 成功分化为功能性肝细胞。

4. 肝内胚层阶段细胞制备的细胞片具有优越的形态和肝脏特征：为了制备肝细胞样细胞片，研究人员在 iPSC、HE 和 IMH 阶段将分化细胞从普通组织培养板转移到温度响应性细胞培养皿（TRCD）中，培养至 MH 阶段。结果发现，iPSC/MH 和 DE/MH 组的细胞无法附着在 TRCD 上，HE/MH 组细胞呈现立方体形的肝细胞样形态和明显的细胞间连接，而 IMH/MH 组细胞则呈现扁平形态。此外，HE/MH 组制备的细胞片比 IMH/MH 组更厚更大，且表达更高水平的肝细胞特异性标记，这表明 HE 阶段的细胞适合制备功能性细胞片。

5. 工程化细胞片相比传统组织培养塑料系统，增强了肝细胞特异性和细胞粘附蛋白标记：通过 H&E、IHC 和 qRT-PCR 分析，研究人员对工程化细胞片的肝细胞特征进行评估。IHC 分析显示，工程化细胞片 SOX2（iPSC 标记）呈阴性，FIX、HNF4a 和 AFP（肝细胞标记）呈阳性。qRT-PCR 分析表明，细胞片形成增强了细胞粘附蛋白（F - 肌动蛋白、β- 连环蛋白和 NCAM1）的表达，且细胞片组的肝细胞标记（HNF4a、AFP、白蛋白）表达水平比在组织培养塑料（TCP）上培养的细胞组高得多，这说明工程化细胞片具有更好的肝细胞特性。

6. 细胞片相比单细胞，增强了凝血 FIX 蛋白的分泌：研究人员对比了单细胞组和细胞片组的情况，发现单细胞组的分化肝细胞呈现细长的细胞形态，与典型肝细胞不同，且由于缺乏细胞间连接，无法长时间维持肝细胞特性和活力，到第 20 天已无法维持。而细胞片组在长达 20 天的时间内都保持了肝细胞形态，且在 1 - 5 天内，细胞片组分泌的 FIX 蛋白比单细胞组高 5 - 11 倍，这表明细胞片在维持肝细胞功能和分泌 FIX 蛋白方面具有明显优势。

7. 细胞片移植在 NOD-SCID 小鼠中保留了 FIX 分泌功能：研究人员将细胞片和单细胞分别移植到 NOD-SCID 小鼠的肝脏表面，发现细胞片移植过程顺利，能在 15 分钟内固定在预定位置。而单细胞注射后，8 只小鼠中有 2 只在 1 小时内死亡，解剖发现注射的单细胞聚集在肝脏血管中，可能阻塞血液循环。两周后，在细胞片移植组的肝脏表面观察到移植的细胞，且这些细胞表达人特异性标记（波形蛋白）和 FIX，细胞片组的人细胞 GAPDH 基因和 FIX 基因表达水平显著高于单细胞组，这表明移植的细胞片在体内至少两周内保持了功能。

综合研究结果，研究人员得出结论：他们成功制备了源自 iPSCs 的肝细胞样细胞片，并将细胞片技术与基因组编辑平台相结合，为血友病 B 的治疗提供了一种新的策略。这种工程化的 FIX 分泌细胞片相比当前的细胞治疗工具，能够更长时间地分泌 FIX 蛋白，在血友病 B 的治疗中具有巨大的潜力。

在讨论部分，研究人员指出，他们使用 CRISPR/Cas9 系统将 FIX 基因插入到 iPSCs 的 APOC3 位点，为基因编辑干细胞治疗血友病 B 提供了一个新的位点选择，该位点插入的好处是可以使移植细胞标准化。此外，从 FIX KI-iPSCs 分化而来的肝细胞功能正常且致瘤风险低，其 FIX 分泌水平比之前研究中靶向 AAVS1 位点和外显子 2 插入人 FIX 基因的细胞更高。细胞片技术有效解决了单细胞注射治疗存在的问题，如治疗效果不一致、移植效率低和细胞功能不足等。通过温度响应性细胞培养皿制备的细胞片，增强了细胞粘附蛋白的表达和 FIX 分泌能力，且在体内移植实验中，细胞片移植相比单细胞注射具有更多优势，如更高的细胞移植量、更好的细胞存活和功能维持等。虽然该研究存在一些局限性，如未在疾病模型上评估治疗效果、细胞片和单细胞组的细胞剂量差异可能影响结果等，但这项研究仍然为血友病 B 的治疗开辟了新的道路，有望推动再生治疗方法的发展，为患者带来新的希望 。