肝脏研究重大突破：发现稳态肝脏中肝细胞预激胆管细胞

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【字体：大中小】 时间：2025年02月25日 来源：Cell Reports 7.5

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　　为解决胆管上皮细胞（BECs）在稳态肝脏中的异质性及再生作用不明等问题，San Raffaele Telethon 基因治疗研究所的研究人员开展了通过体内慢病毒基因转移识别稳态肝脏中肝细胞预激胆管细胞的研究，发现了具有再生潜力的肝细胞预激 BECs，为基因治疗和肝脏再生研究提供新方向。

　　在人体的 “化工厂”—— 肝脏中，肝细胞和胆管上皮细胞（Biliary Epithelial Cells，BECs）共同维持着肝脏的正常运转和再生功能。肝脏的再生能力十分强大，部分肝切除后它能重新生长，移植一小部分肝脏组织也能重构整个肝脏。肝细胞作为肝脏的主要细胞，不仅能自我更新，还能在受损肝脏中定植并重新填充。而 BECs 也不甘示弱，它们被认为是兼性肝脏干细胞，在体外可形成类器官，还能在受损肝脏中定植，参与肝脏的再生过程。当肝细胞的增殖受到阻碍时，BECs 甚至能转分化为肝细胞。

然而，目前对于 BECs 在稳态肝脏中的异质性及其在肝脏再生中的具体作用，科学家们还没有完全弄清楚。这就好比在一个庞大的工厂里，虽然知道有一群特殊的工人（BECs）能在关键时刻帮忙恢复生产（肝脏再生），但却不清楚这群工人内部有哪些不同类型，各自又承担着怎样的职责。在基因治疗领域，这一知识空白也成为了绊脚石。因为如果不能精准地靶向这些具有再生能力的细胞，基因治疗的效果就可能大打折扣。例如，在治疗一些遗传性肝脏疾病时，虽然通过静脉注射腺相关病毒（AAV）载体来传递功能基因取得了一定成果，但 AAV 载体的非整合性质使得治疗性转基因在肝细胞增殖时难以持续发挥作用。所以，深入了解 BECs 的生物学特性迫在眉睫。

为了揭开 BECs 的神秘面纱，San Raffaele Telethon 基因治疗研究所的 Michela Milani 等人开展了一项重要研究。他们通过向小鼠和非人灵长类动物（NHPs）体内进行慢病毒（LV）基因转移，深入探究了 BECs 的特性。该研究成果发表在《Cell Reports》期刊上。

研究人员为了开展此项研究，运用了多种关键技术方法。在细胞和分子生物学层面，使用了慢病毒介导的基因转移技术，将携带特定基因的慢病毒导入细胞；通过荧光激活细胞分选（FACS）技术对细胞进行分选，从而获取特定的细胞群体；利用 RNA 测序（RNA-seq）技术分析细胞的转录组，了解基因表达情况。在动物实验方面，构建了多种小鼠模型，如 Alb-CreERT2/Confetti 小鼠模型，用于追踪特定细胞；还对小鼠和非人灵长类动物进行了各种处理，包括给予有毒饮食诱导肝脏损伤、进行器官移植实验等。

研究结果主要如下：

高效稳定的基因转移：通过向新生小鼠静脉注射表达绿色荧光蛋白（GFP）的慢病毒，研究人员发现慢病毒能高效地将基因转移到肝内 BECs 中，且平均有 10%-15% 的 GFP 阳性 EpCAM 阳性细胞，载体拷贝数（VCN）在 1 - 5 之间。此外，这些被标记的 BECs 在体内能长期维持，1 年后其比例和 VCN 仍处于之前的分析范围内，表明慢病毒介导的基因转移可实现对 BECs 的长期标记和追踪。
揭示胆管细胞异质性：研究人员假设慢病毒优先转导更倾向于向肝细胞分化的 BECs 亚群。通过对转导后的细胞进行分析，发现 LV 转导的 GFP 阳性 BECs 在 TROP2 阴性群体中富集，且器官形成效率与 TROP2 表达无关。基因表达分析显示，GFP 阳性 BECs 及其衍生的类器官中，肝细胞特异性基因（如 Alb、HNF4a 等）表达较高，而胆管细胞特异性基因表达较低。转录组分析进一步揭示，GFP 阳性和阴性 EpCAM 阳性细胞之间存在显著的基因表达差异，GFP 阳性细胞具有明显的肝细胞特征，且该特征在人源和非人灵长类动物的 BECs 中也存在，表明存在一种肝细胞预激的 BECs 亚群，且该亚群可通过体内 LV 转导和高 Alb 表达两种方式识别。
对肝脏损伤的响应：给新生小鼠转导 LV.GFP 后，用含 0.1% 3,5 - 二乙氧基羰基 - 1,4 - 二氢吡啶（DDC）的有毒饮食诱导肝脏损伤。结果发现，GFP 阳性 BECs 在受损肝脏中显著增殖，其比例在 DDC 喂养的小鼠中比对照组增加了 3 倍，表明该 BECs 亚群在肝脏损伤时能优先响应并参与再生过程。
非人灵长类动物研究：研究人员利用从接受 LV 治疗的非人灵长类动物肝脏中分离的 BECs 进行实验，发现这些 BECs 能形成类器官，且类器官中检测到 LV 的 VCN 和转基因表达。同时，类器官在不同培养条件下可向不同方向分化，在体内移植实验中，LV 转导的 BECs 衍生的类器官能在免疫缺陷小鼠中定植并表达转基因，表明非人灵长类动物的 BECs 可进行体内 LV 转导，且转导后能维持体外类器官形成和体内定植的潜力。

在结论与讨论部分，该研究成功识别出在稳态肝脏中存在的肝细胞预激 BECs，它们具有再生潜力，且对体内 LV 介导的基因转移高度敏感。这一发现为基因治疗开辟了新的方向，因为 LV 转导的胆管细胞在肝脏受损时能参与转基因表达并替代肝细胞，有望维持治疗效果，尤其在治疗遗传性代谢性肝病方面具有重要意义。此外，研究还揭示了 BECs 的内在异质性，为进一步研究肝脏再生、胆管癌形成机制以及开发新的治疗策略奠定了基础。不过，研究也存在一些局限性，如肝细胞预激 BECs 亚群在体内的转分化潜力还需进一步研究，且在非人灵长类动物中无法分离 LV 阳性和阴性亚群，限制了对 BECs 异质性的深入研究。但总体而言，该研究成果为肝脏生物学和基因治疗领域提供了重要的理论依据和实践指导，推动了相关领域的发展。

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