利用木豆叶提取物合成的 Al?O?纳米晶体固定真菌 β- 葡萄糖苷酶原位生产染料木黄酮的研究

为解决寻找创新且经济有效的染料木黄酮生产方法的问题，GC University Lahore 的研究人员开展了用 Al?O?纳米晶体固定真菌 β- 葡萄糖苷酶原位生产染料木黄酮的研究，结果表明该方法成本效益高、产量高且无副产物，对相关疾病治疗有潜在意义。

　　

一、研究背景

在生命科学和健康医学领域，寻找安全、有效的天然化合物来替代传统药物，一直是科研人员不懈探索的方向。染料木黄酮（genistein）作为一种具有重要生物活性的物质，其化学结构与雌激素类似，在癌症、哮喘、肥胖、关节炎和神经退行性疾病等的防治方面展现出巨大潜力，吸引了众多科研人员的目光。

β- 葡萄糖苷酶（β-glucosidase）能够将糖苷转化为苷元异黄酮，从而提升雌激素活性，在染料木黄酮的生物合成中扮演着关键角色。然而，游离的 β- 葡萄糖苷酶稳定性欠佳，在实际应用中受到诸多限制。为了改善这一状况，将其固定在合适的载体上成为研究热点。金属纳米晶体（NCs）因具备独特的性质，成为理想的酶固定化载体之一。其中，Al?O?纳米晶体（Al?O? NCs）具有化学稳定性好、机械强度高和比表面积大等优势，在生物技术和生物医学领域应用前景广阔，但此前将其用于固定 β- 葡萄糖苷酶的研究尚属空白。

此外，木豆（Cajanus cajan）叶子富含槐糖苷（sophoricoside），槐糖苷可在微生物作用下经 β- 葡萄糖苷酶转化为染料木黄酮。但以往从木豆中提取和转化有效成分的方法存在效率不高、成本较高等问题。基于此，开发一种高效、低成本且绿色环保的方法来生产染料木黄酮迫在眉睫。

GC University Lahore 的研究人员针对这些问题展开了深入研究，旨在找到创新且经济有效的方法，利用木豆叶提取物合成的 Al?O?纳米晶体固定真菌 β- 葡萄糖苷酶，实现原位生产染料木黄酮，相关研究成果具有重要的科学意义和应用价值，目前该研究成果发表于《Scientific Reports》。

二、研究方法

1. 材料准备：研究中使用的所有化学试剂均为分析级，购自 IIB 化学商店。木豆叶采自 Government College University Botanic Garden。
2. 关键技术
   • β- 葡萄糖苷酶生产与优化：采用野生型米曲霉（A. oryzae）Isl-9 菌株，在不同条件下进行液体发酵培养，优化碳源、氮源、温度、时间等参数，获取 β- 葡萄糖苷酶。
   • Al?O?纳米晶体合成与优化：以木豆叶提取物为原料，通过添加 Al?(NO?)?和 NaOH 反应合成 Al?O?纳米晶体，并对反应参数进行优化。
   • β- 葡萄糖苷酶的固定化：将 β- 葡萄糖苷酶通过交联法固定在 Al?O?纳米晶体上。
   • 产物分析与表征：运用 UV-Vis 光谱、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X 射线衍射（XRD）、扫描电子显微镜（SEM）和 Zeta 电位测量等技术，对合成的 Al?O?纳米晶体、固定化酶以及生物转化产物进行全面分析和表征。

三、研究结果

1. 木豆叶提取物制备
   • 不同稀释剂的影响：研究发现，在多种稀释剂中，蛋白胨生理盐水作为提取剂效果最佳。在波长 225nm 和 250nm 处，其吸光度分别为 0.357 和 0.418，获得的最大沉淀量分别为 (0.2±0.07) mg/mL 和 (0.2±0.10) mg/mL。这可能是因为蛋白胨生理盐水作为最佳水解剂具有良好活性，且能减少叶片组织的氧化应激负面影响，同时富含含氮物质和氨基酸。
   • 蛋白胨生理盐水体积的影响：对蛋白胨生理盐水的体积进行优化时发现，18.75mL 和 31.25mL 的蛋白胨生理盐水在提取木豆叶时效果较好，对应的沉淀量分别为 (0.31±0.078) mg/mL 和 (0.34±0.08) mg/mL ，但 18.75mL 时沉淀效果更优。
   • 不同温度的影响：不同温度对木豆叶提取的影响研究表明，60°C 时效果最佳，此时获得的沉淀量分别为 (0.64±0.07) mg/mL 和 (0.89±0.08) mg/mL ，在 225nm 和 250nm 处的吸光度分别为 0.717 和 0.972。
2. 米曲霉 Isl-9 菌株产 β- 葡萄糖苷酶
   • 不同碳水化合物源的影响：在多种碳水化合物源中，以蔗糖为碳源时 β- 葡萄糖苷酶产量较高。当蔗糖浓度为 4.5%（w/v）时，β- 葡萄糖苷酶活性达到 3.5±0.10U/mg ，且菌丝体生物量产量也较高。
   • 不同钾源的影响：研究发现，KH?PO?作为钾源时，更有利于 β- 葡萄糖苷酶的生产。在浓度为 0.075%（w/v）时，β- 葡萄糖苷酶活性可达 4.01±0.87U/mg 。
   • 不同时间间隔的影响：通过比较 30min 和 60min 的反应时间，发现 60min 时 β- 葡萄糖苷酶活性更高，达到 2.58±0.67U/mg 。
   • 不同培养温度的影响：在 24°C - 42°C 的培养温度范围内，30°C 时 β- 葡萄糖苷酶产量最高，活性可达 5.55±0.081U/mg 。
3. Al?O?纳米晶体的表征
   • UV-Vis 光谱分析：UV-Vis 光谱分析显示，Al?O?纳米晶体在 300nm 处有较强吸收峰。不同浓度 Al?(NO?)?合成的 Al?O?纳米晶体中，30mM 时效果最佳，在 230nm 和 215nm 处分别有吸收峰，吸光度为 3.0 和 3.25。
   • FTIR 光谱分析：FTIR 光谱表明，固定化酶光谱中在 561、599 和 665cm?1 处出现明显峰，对应 Fe - O 和 Al - O 的拉伸振动，证实了 Al?O?纳米晶体的合成和稳定。
   • XRD 分析：XRD 分析显示，Al?O?纳米晶体在 10.17、13.32、17.83、27.91、32.25、38.92 和 45.56 处出现结晶峰，晶体尺寸为 51.5nm，其结晶性质有助于提高 β- 葡萄糖苷酶的固定化和活性。
   • SEM 分析：SEM 分析通过不同放大倍数观察，确定 Al?O?纳米晶体固定化 β- 葡萄糖苷酶的颗粒尺寸为 41.8nm，同时呈现出颗粒的形态和分布。
   • Zeta 电位测量：Zeta 电位测量结果显示，Al?O?纳米晶体的最高峰值为 - 21.0mV，表明其带负电荷且在介质中分散稳定。
4. 槐糖苷生物转化为染料木黄酮的优化
   • 底物水平的影响：研究不同底物水平对生物转化的影响时发现，以木豆叶提取物为底物，最佳底物水平为 2.5%（v/v）。在此条件下，Al?O?纳米晶体交联的 β- 葡萄糖苷酶比游离 β- 葡萄糖苷酶产生更多的染料木黄酮。
   • 酶浓度的影响：对酶浓度进行优化，结果表明，当酶浓度为 1.0%（v/v）时，固定化酶的染料木黄酮产量最高，且明显高于游离酶，达到 1.3±0.66mg/mL 。

四、研究结论与意义

本研究成功实现了利用木豆叶提取物合成的 Al?O?纳米晶体固定真菌 β- 葡萄糖苷酶原位生产染料木黄酮。研究人员对木豆叶提取物制备、β- 葡萄糖苷酶生产、Al?O?纳米晶体合成与表征以及槐糖苷生物转化为染料木黄酮的各个环节进行了系统优化，获得了理想的实验结果。

该研究成果意义重大。从经济角度看，该方法成本效益高，利用木豆这一常见植物资源，减少了昂贵原料的使用；从生产角度讲，产量高且无副产物，提高了生产效率和产品质量。在医学应用方面，为染料木黄酮在癌症、哮喘、肥胖、关节炎和神经退行性疾病等的治疗研究提供了新的方向和方法，有望推动这些疾病治疗药物的开发，为患者带来新的希望。同时，研究中强调的绿色合成纳米晶体、优化酶活性和生物转化效率等方面，也为生物医学和生物技术领域的发展提供了有价值的参考，展现出巨大的应用潜力。