结核分枝杆菌DNA聚合酶持续合成因子(DnaN)的结构-功能-稳定性关系研究及其抗结核药物靶点潜力

【编辑推荐】本研究通过构建耻垢分枝杆菌dnaN条件性敲除株(MsmΔdnaN)，首次证实结核分枝杆菌滑动夹(DnaNMtb)可功能性互补，并鉴定出R115/F116/E319等关键界面残基。结合生物物理、生化及分子动力学(MD)模拟，揭示这些残基通过维持二聚体稳定性影响DNAP持续合成功能，为开发靶向结核滑动夹的小分子抑制剂/拟肽药物提供了新思路。

【研究亮点】

Mtb DnaN可功能性替代耻垢分枝杆菌DnaN

我们通过转座子插入测序和CRISPR干扰证实dnaN是耻垢分枝杆菌(Msm)生存必需基因。为探究其在分枝杆菌生长中的作用，构建了dnaN条件性敲除株(MsmΔdnaN)。首先在Msm基因组不同位点整合了带Flag标签、受四环素(Tet)启动子调控的dnaN基因(图S2)，随后替换原始基因组拷贝。通过该系统，我们成功用结核分枝杆菌DnaN(DnaN^Mtb)实现了功能互补。

【计算机模拟分析显示蛋白-DNA与蛋白-蛋白互作区域存在高度动态性】

基于I-TASSER服务器以晶体结构为模板构建Mtb DnaN模型，经GalaxyWeb服务器优化后，对DnaN及其丙氨酸突变体进行500纳秒分子动力学(MD)模拟。计算均方根偏差(RMSD)、均方根涨落(RMSF)和回转半径(R_g)，并绘制自由能景观图(FEL)。结果显示...

【讨论】

本研究通过构建Mtb滑动夹亚基界面突变体，在体外系统阐明了其结构-功能关系。通过在结核分枝杆菌近缘种耻垢分枝杆菌中构建dnaN条件性敲除株，不仅验证了该蛋白对细菌生存的关键作用，更揭示了特定亚基界面突变如何影响蛋白功能。这些发现为开发靶向结核滑动夹的新型抗菌药物奠定了理论基础。

【实验方法】

菌株与培养条件

所有克隆与突变实验使用大肠杆菌XL1-Blue。重组蛋白纯化采用NiCo21(DE3)菌株(NEB)。耻垢分枝杆菌mc2155培养使用含2%葡萄糖和0.05%吐温-80的MB7H9培养基。

【作者贡献声明】

Meenakshi Mulye：撰写初稿，可视化，验证，方法论，研究实施，数据整理，概念化。Vikas Jain：论文审阅与编辑，验证，监督，资源调配，项目管理，研究实施，资金获取，形式分析，概念化。

【利益冲突声明】

作者声明不存在可能影响本研究的财务或个人利益冲突。

【致谢】

感谢IISER Bhopal提供的技术支持，特别鸣谢Amit Singh教授馈赠含zeocin抗性基因的pMV762 Mrx1-roGFP2质粒。本研究部分由印度政府ANRF基金资助。