《Journal of Advanced Research》：Plasma apolipoprotein E protein attenuates pulmonary fibrosis through LRP1 and PLAU dual receptor-mediated TGF-β/Smad inhibition
特发性肺纤维化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF)是一种致命的慢性间质性肺病，其特点是肺部进行性、不可逆的瘢痕形成，最终导致呼吸衰竭和死亡。尽管在理解遗传和环境风险因素方面取得了进展，但驱动纤维化的分子机制仍然难以捉摸，治疗选择仅限于减缓疾病进展。目前IPF的标准治疗药物包括吡非尼酮和尼达尼布，它们能缓解疾病进展，但生存获益有限，诊断后中位生存期仅为3-5年。这种治疗停滞凸显了针对纤维化上游驱动因子的新策略的迫切需求。
在病理上，IPF的特征是形成由肌成纤维细胞、成纤维细胞和其他细胞类型组成的纤维化病灶，这些细胞将过量的细胞外基质(Extracellular Matrix, ECM)成分分泌到肺泡结构中，导致肺间质内大量ECM沉积、进行性气体交换衰竭和患者死亡。在这些细胞效应器中，肺成纤维细胞来源的肌成纤维细胞是ECM失调的主要贡献者，通过转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor-β1, TGF-β1)等促纤维化介质的持续激活而发挥作用。在病理刺激下，成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，其特征是α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth Muscle Actin, α-SMA)应力纤维形成和过度分泌表型，过度产生胶原蛋白和纤连蛋白等纤维状ECM蛋白。值得注意的是，在临床前模型中，药理学抑制成纤维细胞活化可显著减轻肺纤维化，突显了该过程作为治疗关键点的地位。
循环蛋白质组是介导器官间通讯和组织稳态的动态蛋白质库，已成为慢性疾病的生物标志物来源和治疗靶点库。其中，载脂蛋白因其在调节炎症反应、氧化应激和组织重塑方面的多效性作用而在肺部疾病发病机制中日益受到关注。特别是载脂蛋白E(Apolipoprotein E, apoE)，它是血浆脂蛋白的多功能成分，通过与低密度脂蛋白受体(Low-Density Lipoprotein Receptor, LDLR)家族成员(如LRP1、VLDLR和LRP8)相互作用，协调脂质代谢和神经元修复。虽然APOE多态性是阿尔茨海默病和心血管风险的既定修饰因子，但新出现的证据表明其通过单核细胞来源的肺泡巨噬细胞参与纤维化消退。然而，血浆apoE水平与肺纤维化之间的因果关系，特别是其对成纤维细胞活化的调节作用，仍未得到探索。
为了回答这些问题，研究人员开展了一项整合了多组学数据集荟萃分析、两样本孟德尔随机化(Mendelian Randomization, MR)和跨物种实验验证的研究，以确定血浆apoE在IPF发病机制中的因果作用。该研究发表于《Journal of Advanced Research》，揭示了血浆apoE通过双重受体(LRP1和PLAU)的参与抑制TGF-β/Smad驱动的成纤维细胞活化，最终减轻纤维化重塑。此外，研究人员还确定了RGX-104，一种小分子肝X受体(Liver X Receptor, LXR)激动剂，作为APOE轴的药理学激活剂，可在小鼠模型和人肺切片中减轻纤维化。这项工作将血浆apoE确立为IPF的潜在诊断生物标志物和治疗靶点，弥合了遗传流行病学与转化发现之间的差距。
关键技术与方法
本研究采用了多组学整合与跨物种验证的策略。首先，研究人员对7个血浆队列和2个组织队列进行了荟萃分析，并结合两样本孟德尔随机化分析，以评估血浆蛋白与IPF风险的因果关联。其次，利用CRISPR/Cas9技术构建了APOE基因敲除(APOE-KO)犬和Apoe-/-小鼠模型，以研究apoE缺失对肺纤维化的影响。在机制探索方面，运用单细胞转录组学技术分析了人肺组织细胞图谱，以鉴定成纤维细胞富集的apoE受体；采用SPIDER技术结合表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)来表征新的apoE相互作用蛋白。在治疗潜力验证方面，在博来霉素(Bleomycin, BLM)诱导的小鼠肺纤维化模型和人肺切片(Precision-Cut Lung Slices, PCLS)中，测试了LXR激动剂RGX-104的治疗效果。此外，还通过免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)、分子对接、蛋白质印迹(Western Blot, WB)和免疫荧光等技术，深入阐明了apoE通过LRP1和PLAU双受体抑制TGF-β/Smad信号通路的分子机制。
研究结果
整合荟萃分析和孟德尔随机化揭示血浆apoE对IPF具有保护作用
为了系统研究IPF的蛋白质组学图谱，研究人员对28项研究进行了荟萃分析，包括7个基于血浆的队列(761名参与者；488名IPF患者 vs 273名对照)。血浆蛋白质组学分析揭示了431个差异表达蛋白，其中血浆apoE在IPF患者中显著降低。为了建立因果关系，研究人员进行了两样本MR分析，利用顺式蛋白数量性状位点(cis-pQTLs)作为工具变量。MR分析揭示了18种与IPF风险相关的因果血浆蛋白：9种保护因子和9种风险增强因子。值得注意的是，血浆apoE在分析中表现出一致的保护作用，使其成为最稳健的候选因子。此外，MR分析还显示，基因决定的apoE水平升高与肺功能改善(如FEV1和FVC)呈正相关，并抑制了促纤维化介质MIP-1β/CCL4和bFGF的水平。在一项包含32名健康对照、32名间质性肺病(ILD, 非IPF)患者和24名IPF患者的多组队列研究中，验证了血浆apoE水平在疾病状态下呈进行性耗竭，IPF患者的减少最为显著。受试者工作特征(ROC)分析表明，血浆apoE对IPF的识别具有优越的判别能力。
APOE缺陷犬自发再现肺纤维化病理
为了建立人类研究中观察到的apoE与IPF之间的因果关系，研究人员通过CRISPR/Cas9编辑和体细胞核移植克隆，生成了APOE敲除(APOE-KO)犬。令人惊讶的是，APOE-KO犬在24月龄时表现出自发性肺纤维化病变。苏木精-伊红(H&E)染色显示，纯合APOE-KO犬的肺泡结构显著丧失和紊乱。Masson三色染色显示，纯合APOE-KO犬肺中胶原沉积和纤维化重塑增加。免疫组织化学分析显示，与野生型对照相比，纯合APOE-KO犬中α-SMA、胶原蛋白1和纤连蛋白的阳性区域扩大。分子谱分析证实，纯合APOE-KO犬在蛋白和转录水平上均协调上调了纤维化标志物。这些发现共同证明，apoE在保护大型哺乳动物免受肺纤维化方面发挥着不可或缺的作用。
Apoe缺陷加剧纤维化，而重组apoE减轻小鼠模型中的肺纤维化
研究人员进一步采用博来霉素(BLM)诱导的小鼠模型来检测纤维化进展过程中apoE水平的动态变化。ELISA结果显示，在纤维化进展过程中，血清apoE水平呈进行性降低，同时肺中apoE蛋白和mRNA表达也降低。为了进一步描绘apoE在肺纤维化中的保护作用，研究人员通过CRISPR-Cas9技术生成了Apoe敲除(Apoe-/-)小鼠，并使其接受BLM诱导的肺纤维化。与WT对照相比，BLM诱导的Apoe-/-小鼠表现出更大的病变区域。Masson三色染色切片的组织病理学定量证实，BLM诱导的Apoe-/-小鼠胶原沉积加重。此外，在纤维化严重程度标志物羟脯氨酸水平上也得到了类似的结果。分子谱分析显示，BLM诱导的Apoe-/-小鼠在蛋白和转录水平上均协调上调了纤维化标志物，免疫组织化学图谱显示BLM诱导的Apoe-/-小鼠中α-SMA、胶原蛋白1和纤连蛋白阳性区域扩大。在BLM诱导后第14天和第18天，治疗性静脉注射重组apoE蛋白(0.3 mg/kg)显著减少了WT和Apoe-/-小鼠的肺胶原沉积。该治疗同时抑制了WT和Apoe-/-小鼠中关键纤维化标志物的表达。这种表型拯救证实了apoE在减轻纤维化重塑中的功能作用。
单细胞转录组学揭示成纤维细胞特异性LRP1靶向是apoE抗纤维化的重要检查点
为了阐明apoE介导的肺纤维化减轻的细胞靶点和分子机制，研究人员对来自对照和IPF肺的整合单细胞RNA-seq数据集进行了分析。无监督聚类揭示了21个不同的细胞群，显示IPF患者中肌成纤维细胞显著扩增，同时成纤维细胞比例减少，表明成纤维细胞向肌成纤维细胞转变。对apoE受体表达模式的系统评估显示，LDLR和LRP1在肺中主要表达，而LRP8和VLDLR的检测极少。细胞类型特异性分析显示，LDLR在肺泡2型上皮细胞(AT2)中富集，而LRP1主要在成纤维细胞和肌成纤维细胞中表达，表明通过这些不同的细胞靶点可能存在双重调节途径。功能验证实验表明，apoE给药显著减弱了TGF-β诱导的MRC-5细胞成纤维细胞活化，表现为α-SMA、胶原蛋白1和纤连蛋白蛋白表达以及相应mRNA水平的降低。值得注意的是，apoE未能调节BLM诱导的A549细胞上皮损伤反应，确立了成纤维细胞特异性LRP1靶向作为其主要抗纤维化机制。
双重受体介导的TGF-β/smad信号抑制是apoE抗纤维化作用的基础
尽管发现了LRP1依赖的apoE活性，但在MRC-5细胞中敲低LRP1部分减弱但并未消除apoE对成纤维细胞活化标志物的抑制作用，表明存在替代受体的参与。利用SPIDER技术，研究人员确定了纤溶酶原激活物尿激酶(Plasminogen Activator Urokinase, PLAU)是成纤维细胞中一种新的apoE相互作用蛋白。此外，单细胞数据显示，在肺组织的21种不同细胞类型中，PLAU主要在肌成纤维细胞中表达，在IPF患者中表达水平高于健康对照。通过SPR进行的生物物理学验证证明了apoE-PLAU的强结合。分子对接模拟和HEK293T细胞中的免疫共沉淀进一步支持了这一点。功能研究表明，PLAU敲低加剧了成纤维细胞活化，而双重LRP1/PLAU耗竭产生了协同效应，证实了协同受体参与。
对TGF-β处理的MRC-5细胞进行RNA-seq分析显示，通过主成分分析(PCA)进行不同的聚类，KEGG分析表明抑制TGF-β信号通路是apoE的主要机制。与抑制经典TGF-β信号通路一致，apoE在MRC-5和HLF细胞中抑制了TGF-β诱导的SMAD2/3磷酸化(p-SMAD2/3)以及下游基因(包括胶原蛋白1和PAI1)的表达。免疫荧光进一步证实了这种抑制作用，显示apoE减轻了TGF-β诱导的MRC-5细胞中p-SMAD2/3和SMAD4的核转位。机制验证表明，单个LRP1或PLAU敲低部分恢复了p-SMAD2/3、胶原蛋白1和PAI1的水平，而双重敲低更有效地抵消了apoE在MRC-5和HLF细胞中的抑制能力，证实apoE协调地靶向这两种受体以阻断TGF-β/Smad驱动的成纤维细胞活化。
RGX-104通过LXR驱动的APOE激活减轻小鼠和人类肺模型中的纤维化进展
为了将apoE的治疗潜力转化为临床应用，研究人员对UKB中的784种疾病/性状进行了Phe-MR分析。这确定了18种在多重检验校正后与血浆apoE水平显著相关的结果。通过ChEMBL和ClinicalTrials.gov进行的系统药物发现评估揭示了四种apoE靶向化合物。RGX-104被选为系统评估其抗纤维化潜力的候选药物，因为它被表征为一种小分子LXR激动剂，可转录激活APOE表达。
在BLM诱导的模型中，RGX-104(40 mg/kg，在BLM诱导后第14天和第18天腹腔注射)激活LXR信号不仅恢复了循环和肺中apoE的水平，还上调了其下游靶点Abca1和Abcg1的表达。组织病理学分析表明，RGX-104治疗后胶原沉积和肌成纤维细胞活化显著减少。RGX-104同时抑制了BLM诱导的促纤维化bFGF的增加。从机制上讲，RGX-104减弱了BLM诱导的纤维化小鼠肺中成纤维细胞内TGF-β信号的激活，表现为p-Smad3信号的显著减少。至关重要的是，RGX-104的抗纤维化作用在Apoe敲除小鼠中被消除，证实了LXR-APOE轴的依赖性。进一步分析显示，RGX-104有利地调节了纤维化小鼠的胆固醇代谢，降低了血清LDL-C并升高了HDL-C。
为了评估临床可转化性，研究人员采用了一种人离体肺纤维化模型，用促纤维化混合物刺激人PCLS。RGX-104治疗激活了LXR信号，恢复了apoE水平，并显著降低了纤维化标志物α-SMA、胶原蛋白I和纤连蛋白的表达。从机制上讲，RGX-104有效抑制了混合物诱导的人PCLS中成纤维细胞内TGF-β信号的激活。这些在鼠类和人类离体模型中保守的反应强调了RGX-104通过apoE介导的途径调节治疗IPF的潜力。
研究结论与讨论
本研究通过整合人类遗传学、多组学和跨物种实验，确立了血浆apoE是抵抗适应性不良纤维化重塑的核心守护者。对其通过双重受体介导的TGF-β/Smad信号抑制的机制阐明，加上RGX-104的治疗效果，为IPF中apoE靶向治疗提供了转化路线图。这些进展不仅加深了我们对纤维化发生的理解，也展示了整合方法在弥合分子发现与临床应用方面的力量。
该研究的优势在于其整合方法，结合了观察性研究的荟萃分析、MR和跨物种实验。据我们所知，这是对IPF患者进行的首次全面蛋白质组学分析，确定了431种疾病相关的血浆蛋白。然而，观察性研究本身无法确定因果关系。通过将荟萃分析与两样本MR相结合，研究人员确定了血浆apoE是IPF的稳健保护因子。进一步的MR分析揭示了血浆apoE对肺功能的益处以及促纤维化细胞因子水平的降低，共同支持了apoE的治疗潜力。
本研究的一个关键创新是通过大型和小型动物模型对APOE功能进行跨物种验证。令人惊讶的是，APOE缺陷犬自发地出现了肺纤维化病变，而Apoe-/-小鼠则表现出加重的BLM诱导的纤维化。这种在系统发育上不同物种间保守的纤维化加剧，强调了apoE在维持肺稳态方面的进化作用。
本研究揭示了PLAU是一种新的apoE相互作用蛋白，扩展了对apoE受体的经典理解，超越了LDLR家族成员。PLAU产生的纤溶酶具有广泛的底物特异性，纤溶酶原激活系统与急性肺损伤(ALI)和肺纤维化有关。新出现的证据表明，间质PLAU产生的纤溶酶通过涉及蛋白酶激活受体-1(PAR-1)和其他途径的机制在IPF中发挥强效促纤维化作用。PLAU激活纤溶酶原形成纤溶酶，纤溶酶可以直接或间接通过基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases, MMPs)的级联反应降解ECM成分，并切割/激活ECM结合的潜伏TGF-β，从而增加活性TGF-β的局部水平并驱动纤维化反应。此外，研究表明可溶性PLAU水平可以改变免疫细胞和基质细胞的功能，表明PLAU-纤溶酶轴不仅通过蛋白水解激活TGF-β，还通过调节细胞信号传导和炎症微环境来促进纤维化。矛盾的是，IPF患者在BALF中表现出PLAU水平降低，同时纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI1)浓度升高。值得注意的是，鼻内给予超生理剂量的PLAU或支气管Clara细胞中上皮特异性PLAU过表达增强了肺泡纤溶活性，在实验性肺损伤模型中显示出保护作用。这些发现共同表明PLAU在ALI和IPF进展中的作用具有背景依赖性。我们的研究结果表明，成纤维细胞中apoE-PLAU相互作用抑制了TGF-β/Smad驱动的活化，揭示了纤溶与肺纤维化之间未被充分认识的相互作用。
虽然先前的工作将apoE-LRP1信号传导与巨噬细胞介导的胶原吞噬联系起来，但我们建立了一个以成纤维细胞为中心的机制，其中双重LRP1/PLAU的参与协同抑制TGF-β/Smad信号传导，阐明了一个用于抗纤维化干预的新轴。LRP1和PLAU协同抑制TGF-β信号传导的机制基础可能涉及以下方面：一方面，apoE可以同时直接结合PLAU和LRP1。这种双重受体共占据/复合物的形成可能富集了膜或TGF-β信号复合物胞质区域的apoE介导的抑制信号，从而放大了对Smad磷酸化的抑制。另一方面，LRP1是一种多功能清道夫和信号传导受体，识别至少30种不同的配体，特别是包括apoE和PLAU。与细胞表面受体结合后，配体可被LRP1识别并内化到早期内体-溶酶体途径中。apoE与PLAU的结合可能抑制PLAU的细胞外蛋白水解活性，并将apoE-PLAU复合物重定向到LRP1介导的内存途径中，从而减少局部活性TGF-β的产生，并放大对TGF/Smad信号传导的抑制。
基于Theobald等人的发现，我们研究对apoE介导的成纤维细胞抑制的关注得到了其巨噬细胞适应作用的新证据的补充。他们的工作表明，β-葡聚糖诱导的、Dectin-1/CARD9依赖的ApoE+CD11b+单核细胞来源的肺泡巨噬细胞的产生增强了细菌清除并改善了体内纤维化。这些ApoE依赖性巨噬细胞是糖酵解性的、具有吞噬性，并且在再刺激时产生高水平的IL-6。这强调了apoE可能通过成纤维细胞内在和巨噬细胞介导的机制促进肺恢复力的平行途径，从而拓宽了apoE在IPF中的治疗相关性。
LXR激动剂RGX-104已成为挽救apoE表达和减轻鼠类和人类肺模型中纤维化的潜在治疗候选药物。研究表明，RGX-104通过转录激活APOE来重塑酸性肿瘤微环境，从而减少髓源性抑制细胞(Myeloid-Derived Suppressor Cell, MDSC)浸润以增强抗肿瘤免疫。尽管该药物目前正在进行针对晚期肺癌和子宫内膜癌的I期临床试验，但其在肺纤维化背景下的治疗潜力仍未得到探索。我们的研究开创了其在肺纤维化中的应用。然而，众所周知，LXR激活会促进肝脏脂质积累，这对RGX-104治疗IPF的临床应用构成了重大限制。未来评估RGX-104在IPF患者中的临床试验必须包括严格的肝脏监测。
我们的研究存在几个局限性。首先，我们的研究结果表明，血浆apoE不仅在IPF中显著降低，在非IPF的ILD中也显著降低。鉴于我们验证队列的规模较小，未来需要进行更大规模的研究来确认apoE对IPF的诊断效用，并进一步区分IPF与其他ILD。其次，尽管我们描绘了apoE通过双重受体(LRP1/PLAU)依赖性抑制TGF-β/Smad驱动的成纤维细胞活化的机制，但这些受体之间精确协调的分子相互作用需要进一步阐明。第三，尽管RGX-104在鼠类模型和人类PCLS中显示出有希望的抗纤维化功效，但依赖这些系统可能无法完全再现人类IPF的复杂性，特别是其动态的免疫细胞募集动力学。
