《Neurochemistry International》：Alcohol Disrupts Neural Differentiation Through Endoplasmic Reticulum Stress and PERK Pathway Activation
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酒精暴露通过内质网应激及PERK通路抑制神经分化，研究利用体外神经干细胞和体内胎儿脑模型证实，酒精诱导ER应激并激活PERK，抑制神经元和星形胶质细胞分化，抑制PERK可逆转损伤。
作者：张卓辉、文雯、林虹、胡迪、李辉、罗佳
美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学卡弗医学院病理学系，邮编52242
摘要
产前酒精暴露（PAE）可能导致胎儿酒精谱系障碍（FASD），这是一种以大脑发育缺陷为特征的疾病，会导致神经行为和认知障碍。然而，其背后的分子机制仍不明确。大脑发育是一个高度调控的过程，其中神经发生起着关键作用。这一过程中的一个关键阶段是神经分化，这对正常的大脑功能至关重要。本研究旨在探讨酒精如何干扰神经分化。本研究使用从小鼠胚胎大脑中提取的NE-4C神经干细胞系作为体外模型。作为体内模型，怀孕的小鼠在妊娠第14至16天期间被暴露于酒精中，之后分析了脑室区（VZ）中新形成的神经元。为了研究内质网（ER）应激的作用，使用了含有tunicamycin（TM）和MANF缺陷的NE-4C细胞。通过免疫荧光、免疫印迹和流式细胞术评估神经分化情况。酒精损害了NE-4C细胞向神经元和星形胶质细胞的分化，但不影响细胞迁移。它还引发了ER应激，主要激活了PERK通路。同样，由TM和MANF缺陷引起的ER应激也干扰了神经分化并激活了PERK。抑制PERK可以减轻酒精对神经分化的损害。PAE减少了胎儿大脑VZ中新形成的神经元数量，但对细胞存活和增殖影响较小。因此，酒精引起的ER应激，尤其是PERK的激活，可能是导致FASD相关神经发生障碍的原因。
引言
在美国，13.5%的成年人报告在怀孕期间饮酒，其中5.2%的人在过去30天内有过酗酒行为[1]。产前酒精暴露（PAE）是胎儿酒精谱系障碍（FASDs）的主要风险因素，这些障碍表现为大脑发育异常和行为障碍。对FASDs儿童和青少年的神经影像学研究表明，PAE会导致大脑形态发生显著变化，包括大脑体积和重量的减小[2]。酒精可以穿过胎盘直接影响发育中的胎儿大脑，损害神经发生——这是正常大脑发育的关键过程之一。尽管已经记录了酒精对大脑发育和神经发生的损害，但其背后的细胞和分子机制仍不清楚。
神经发生是发育中的中枢神经系统（CNS）中的一个复杂且严格调控的过程，涉及神经干细胞（NSC）的增殖、迁移和分化。这一过程依赖于高效的蛋白质合成，使NSC能够从静止状态转变为活跃状态。因此，维持蛋白质稳态（proteostasis）对神经发生至关重要。蛋白质稳态包括蛋白质合成、折叠、修饰、降解和运输，内质网（ER）在这些过程中起着关键作用。当蛋白质稳态受到破坏时，未折叠或错误折叠的蛋白质会在ER中积累，从而引发ER应激，触发未折叠蛋白反应（UPR）。UPR的主要功能是通过增加ER伴侣蛋白的表达、增强错误折叠蛋白质的降解以及暂时减少蛋白质合成来恢复平衡[3]。然而，当ER应激变得严重且无法恢复稳态时，UPR会转向凋亡性细胞死亡[3, 4]。UPR主要由三种关键的ER跨膜蛋白调节：PKR样ER激酶（PERK）、肌醇依赖性酶1α（IRE1α）和激活转录因子6（ATF6）。
越来越多的证据表明，酒精暴露会破坏蛋白质稳态并在多个器官系统中引发ER应激，包括肝脏、胰腺、心脏和肺部[5, 6, 7, 8, 9]。我们之前的研究使用体外和体内模型证明，酒精暴露也会在发育中和成熟的CNS中的神经元中引发ER应激[10, 11, 12, 13, 14]。虽然已知酒精会引发ER应激并干扰蛋白质稳态，但目前尚不清楚这些效应是否会影响发育中的大脑神经发生，也不清楚特定UPR信号通路的贡献。在这项研究中，我们使用培养的小鼠NSC体外模型和胎儿小鼠大脑的体内模型，探讨了ER应激在酒精介导的神经分化障碍中的作用。我们的发现表明，酒精通过ER应激，特别是通过激活PERK通路，损害了神经分化。更重要的是，体外和体内实验均表明，抑制PERK通路可以减轻酒精对神经分化的损害。
材料
MEM（11095-080）、FBS、抗生素-抗真菌剂（15240112）、MTT（M5655）、无水DMSO（276855）、全反式RA（R2625）、DAPI（D9542）、Poly-L-lysine hydrobromide（P6282）和GSK2606414（516535）均购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）；PFA（15714）购自Electron Microscopy Sciences（美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德）；DC蛋白检测试剂盒（5000112）购自Bio-Rad Laboratories（美国加利福尼亚州赫拉克勒斯）；GeneArt基因组切割检测试剂盒（A24372）
方法
动物模型和酒精暴露：所有实验程序均得到了爱荷华大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，并遵循美国国立卫生研究院（NIH）指南中规定的实验室动物护理和使用规定。为了研究酒精对大脑发育的影响，怀孕的C57BL6小鼠（The Jackson Laboratory，缅因州巴港）被随机分为两组：对照组和酒精组。
酒精损害神经分化
NE-4C细胞是一种源自小鼠胚胎大脑囊泡的神经干细胞系[18]。当暴露于视黄酸（RA）时，它们可以分化为神经元和星形胶质细胞，是研究神经发生的常用模型[19, 20, 21]。首先，我们研究了酒精对NE-4C细胞存活率的影响。NE-4C细胞被酒精（0.2%-0.8%）处理24小时或72小时。通过MTT检测评估细胞存活率（图1）。0.8%的酒精处理72小时后，细胞存活率显著下降
讨论
在这项研究中，我们使用了体外和体内模型来探讨酒精干扰神经分化的机制，而神经分化和大脑发育是神经发生的关键过程。作为成熟的神经分化体外模型，NE-4C细胞来源于胚胎第9天的前脑囊泡，是具有在RA诱导下分化为神经元和星形胶质细胞能力的增殖神经外胚层干细胞。这些细胞被广泛用于相关研究
作者贡献声明
文雯：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、方法学、研究、数据分析。林虹：方法学、研究、数据分析。张卓辉：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、可视化、方法学、研究、数据分析、概念化。罗佳：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、监督、资源管理、项目协调、研究、资金获取、概念化。胡迪：
利益冲突声明
作者声明他们没有可能影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）的资助（项目编号：AA017226和AA015407）。感谢Jianyu Yu在流式细胞术分析实验中的协助。
