六倍体甘薯中利用CRISPR/Cas9高效编辑植烯去饱和酶

《Plant Science》：An efficient CRISPR/Cas9-mediated editing of phytoene desaturase in hexaploid sweetpotato

CRISPR/Cas9介导的IbPDS基因编辑在紫甘薯‘XZS-8’中高效成功，突变率达98.18%，白化表型验证功能丧失，并建立高效基因编辑平台。

　　

魏唐|孟玛|宋伟汉|孟口|王欣|严辉|陈莉|张艾岑|高天奇|高润飞|张永刚|李强

江苏省徐淮区徐州农业科学研究院/中国农业科学院甘薯研究中心/农业农村部甘薯生物学与遗传育种重点实验室，中国徐州221131

摘要

CRISPR/Cas9介导的基因编辑已成为功能基因组学和作物改良的关键工具。我们首次将CRISPR/Cas9编辑技术应用于紫色肉质品种‘XZS-8’中的〈IbPDS〉基因，实现了高达98.18%的突变效率。〈IbPDS〉基因的功能丧失突变导致了肉眼可见的白化表型。Hi-TOM测序确认了目标位点的缺失突变，编辑效率分别为17.77%至65.90%（gRNA1）和87.87%至98.18%（gRNA2）。敲除系表现出叶绿素a和叶绿素b含量的显著降低，证实了〈IbPDS〉基因的功能紊乱。总体而言，我们的研究结果证明了CRISPR/Cas9在六倍体甘薯中生成突变体的高效性。

引言

甘薯是一种重要的全球粮食作物，以其丰富的碳水化合物、维生素、膳食纤维和必需微量营养素而闻名（Kwak, 2019）。其整个植株，包括叶子、茎和块根，对人类和动物都有多种用途。除了产量高和用途广泛外，甘薯还具备其他经济作物所没有的多个优势，使其成为应对全球粮食安全挑战和缓解气候变化影响的强大工具，特别是在发展中国家普遍采用的农业实践中（Sapakhova et al., 2023）。中国是全球最大的甘薯生产国，占全球总产量的55%（Li et al., 2022）。根据联合国粮农组织的数据，2023年中国甘薯产量为5140万吨（FAO 2023）。

在自然环境中，甘薯的生长不仅受到盐分和干旱等非生物胁迫的制约，还受到细菌、真菌、病毒和茎线虫等生物胁迫的影响。各种生物和非生物胁迫对甘薯产量有显著影响。然而，由于甘薯的高杂合性（2n=6x=90, B₁B₁B₂B₂B₂）及其复杂的遗传背景（Yang et al., 2017），通过传统育种方法精确选择和改良产量、品质和抗逆性等性状非常困难。基因组编辑技术取得了显著进展，使得可以直接对商业作物品种进行精确改造。特别是CRISPR/Cas系统作为一种用户友好、高度特异性且有效的基因组编辑工具，为开发能够抵抗生物和非生物胁迫的作物品种铺平了道路（Erdo?an et al., 2023）。CRISPR/Cas9系统主要由两部分组成：单一引导RNA（gRNA）和Cas9酶（Jinek et al., 2012）。gRNA作为精确导航器，促进Cas9与目标基因组DNA之间的直接碱基配对，从而在预定义的目标位点切割双链DNA，形成双链断裂（DSB）。细胞内的修复途径，即非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR），负责修复这些DSB。NHEJ涉及插入或删除（indels），而HDR则通过重组过程实现所需序列的精确插入或特定点突变的引入（Doudna and Charpentier, 2014, Symington and Gautier, 2011）。

由于甘薯基因组的复杂性和杂合性，进行靶向基因组编辑面临巨大挑战。每个基因存在多个等位基因拷贝，需要高效的编辑系统才能同时修改所有同源基因，这增加了获得可检测且稳定的突变表型的难度。此外，基因组间的遗传冗余和序列差异会降低针对保守区域设计的引导RNA的效果。再加上转化效率有限和基因型依赖的再生能力，这些因素历来阻碍了甘薯中稳健基因组编辑平台的发展。因此，在如Xuzishu 8（XZS-8）这样的优良品种中建立可靠的CRISPR/Cas9系统，对于这一重要且具有气候适应性的作物的功能基因组学和精准育种至关重要。

PDS基因编码的植烯去饱和酶是类胡萝卜素生物合成途径中的关键酶（Fraser et al., 1994）。许多CRISPR/Cas介导的基因组编辑研究利用〈PDS〉作为标记物，促进了CRISPR试剂在植物细胞中的标准化应用（Awasthi et al., 2021, Mainkar et al., 2023, Siddappa et al., 2023）。该基因的破坏会引发一系列效应，包括光漂白、白化表型的出现和植株矮化（Vaia et al., 2022）。最近的研究表明，通过CRISPR/Cas9系统可以高效编辑甘薯中的〈PDS〉基因（Casarin et al., 2022；Brewer, Chambers 2022；Li et al., 2023；Gupta et al., 2023等）。然而，目前尚未有关于甘薯中〈IbPDS〉基因的CRISPR/Cas9应用报道。

在本研究中，我们开发了首个针对中国新型紫色肉质甘薯品种‘XZS-8’中〈IbPDS〉基因的CRISPR/Cas9编辑系统，实现了比以往甘薯研究更高的编辑效率（高达98.18%（Tang et al., 2025；Wang et al., 2019））。通过〈IbPDS〉基因敲除诱导的叶绿素缺乏白化表型验证了成功的突变。我们的发现证明了CRISPR/Cas9在甘薯中的高效基因组编辑能力，推动了甘薯育种的进展，并为培育具有更强抗生物和非生物胁迫能力以及改良品质特性的品种奠定了基础。

植物材料

本研究使用了来自江苏省徐淮区徐州农业科学研究院的紫色肉质甘薯‘XZS-8’，该品种具有高花青素含量、高产量、良好口感和耐旱性（Yan et al., 2022）。从‘XZS-8’中提取顶端分生组织，并在添加了2毫克/升2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）的MS（Murashige and Skoog, 1962）培养基上培养胚性愈伤组织，以进行后续遗传操作

IbPDS的克隆和序列分析

使用针对〈IbPDS〉基因序列的特异性引物，我们扩增了一段4,737个碱基对的片段（GenBank登录号：PV959548），随后对其进行克隆并进行了Sanger测序。序列比对显示，〈IbPDS〉基因由14个外显子和13个内含子组成（图1A）。保守结构域分析（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）确定了〈IbPDS〉中的多个PLN02612超家族，包括位于4,381至4,584碱基对位置的主要结构域

讨论

CRISPR/Cas9已成为植物精确基因组编辑的强大工具，可实现功能基因组学和作物改良的靶向突变。虽然已在小麦（Abdallah et al., 2025；Sánchez-León et al., 2018）、水稻（Chen et al., 2024；Zhou et al., 2025）、玉米（Shi et al., 2024；Zhao et al., 2025）、马铃薯（Abeuova et al., 2023；Karlsson et al., 2024）、大豆（Luo et al., 2024；Xiang et al., 2024）等主要作物中取得了成功应用，但其

结论

我们确定了全长〈IbPDS〉基因组序列，包含14个外显子和13个内含子。利用胚性愈伤组织和双gRNA的CRISPR/Cas9系统，针对〈IbPDS〉第13外显子中的PLN02612结构域，成功建立了一个高效的基因编辑平台，最大编辑效率达到98.18%，并在8-10周内产生了明显的白化表型。本研究提供了一种基因编辑策略和平台，加速了甘薯基因组编辑的优化

CRediT作者贡献声明

李强：撰写——审稿与编辑，监督，资金获取。魏唐：撰写——初稿，研究，概念构思。孟玛：撰写——审稿与编辑。张艾岑：软件支持。高天奇：数据可视化，方法学。高润飞：研究，数据管理。张永刚：监督，项目管理。孟口：资源协调。王欣：资源获取。严辉：正式分析。陈莉：方法学，研究。宋伟汉：资金获取，数据管理。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：李强报告称获得了CARS-10-Sweetpotato专项基金的资助。宋伟汉报告获得了江苏省自然科学基金的资助。孟口报告获得了江苏省徐淮区徐州农业科学研究院部门发展基金的资助。

致谢

本工作得到了CARS-10-Sweetpotato专项基金、江苏省自然科学基金（BK20240327）以及江苏省徐淮区徐州农业科学研究院部门发展基金项目（2024BM004）的支持。

作者声明没有可能影响本研究的财务利益或个人关系。