苯丁锡通过氧化应激和破坏线粒体可塑性诱导斑马鱼多器官毒性

《Redox Biology》：Multi-organ toxicity via oxidative stress and disrupting mitochondrial plasticity induced by bendiocarb in zebrafish

本研究针对氨基甲酸酯类杀虫剂苯丁锡对非靶标生物（尤其是水生生物）的发育毒性机制不清的问题，通过斑马鱼模型开展了多器官毒性评价。研究发现苯丁锡暴露通过诱发氧化应激、破坏线粒体功能（如抑制复合物I、III、V基因表达，降低ATP生成）和可塑性（如诱导线粒体分裂、抑制融合），导致斑马鱼幼鱼出现心脏毒性、血管发育异常、肝胰毒性及神经发育缺陷。重要的是，抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）能显著缓解上述毒性。该研究发表于《Redox Biology》，为系统评估苯丁锡的环境风险提供了新的视角和分子机制依据。

　　

在农业生产和公共卫生领域，氨基甲酸酯类杀虫剂被广泛用于控制害虫和病媒传播。苯丁锡（Bendiocarb）便是其中一员，它通过不可逆地抑制昆虫体内的乙酰胆碱酯酶（AChE）发挥杀虫作用。然而，随着其用量的增加，其在环境中的残留问题日益凸显。监测研究显示，苯丁锡在沙特阿拉伯的地下水以及日本的河水中均有检出，甚至在人类母体血液和脐带血浆中也发现了其残留。这些发现警示我们，苯丁锡可能通过环境暴露进入并积累于脊椎动物体内，包括处于敏感发育阶段的胚胎和胎儿。尽管已有研究报道了苯丁锡在哺乳动物等模型中的急性和器官特异性毒性，但其对生物体早期发育过程中多器官、系统水平的毒性影响及其复杂的分子机制仍知之甚少。

为了填补这一知识空白，来自韩国成均馆大学（Sungkyunkwan University）的Kyu Seomoon、Hojun Lee、Taeyeon Hong、Junho Park、Wei Ying、Gwonhwa Song、Wooyoung Jeong和Whasun Lim研究团队，利用斑马鱼这一理想的毒理学研究模型，在《Redox Biology》期刊上发表了一项研究，系统揭示了苯丁锡通过氧化应激和破坏线粒体可塑性诱导斑马鱼多器官毒性的新机制。斑马鱼具有胚胎透明、发育快速、与人类基因同源性高（>70%）等优势，并且拥有多种器官特异性的荧光报告品系，使得实时观察早期发育过程中多个器官的形态和功能变化成为可能。

研究人员为开展此项研究，运用了多项关键技术方法。他们首先通过鱼类胚胎急性毒性（FET）测试确定了苯丁锡对斑马鱼幼鱼的半致死浓度（LC₅₀），并据此设定了后续实验的非致死浓度。研究核心在于利用多种转基因斑马鱼品系（如cmlc2:dsRed标记心脏、fli1a:EGFP标记血管、fabp10a:dsRed标记肝脏、insulin:EGFP/elastase:EGFP标记胰腺、olig2:dsRed/gad1b:EGFP标记神经）进行器官特异性毒性评估。在机制探索层面，他们采用了DCFH-DA和MitoSOX染色检测活性氧（ROS）水平，通过Seahorse能量代谢分析仪评估线粒体呼吸功能，利用蛋白质印迹（Western Blot）分析Pink1蛋白表达，并借助实时定量PCR（qPCR）和整体原位杂交（WISH）技术检测相关基因的表达变化。此外，还通过丙烯橙（acridine orange）染色和TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记）法检测细胞凋亡情况。为了验证氧化应激的核心作用，研究还设置了N-乙酰半胱氨酸（NAC）救援实验。

3.1. 苯丁锡引发的斑马鱼发育和形态缺陷

研究人员发现，苯丁锡暴露会降低斑马鱼幼鱼的存活率，其96小时LC₅₀为19.14 mg/L。在非致死浓度（1, 2, 4 mg/L）下，苯丁锡引起了一系列形态学异常，包括体长缩短、头部和眼睛尺寸减小以及心包水肿区域显著增大。这些结果表明苯丁锡干扰了斑马鱼正常的胚胎发育过程。

3.2. 苯丁锡诱导的氧化还原平衡破坏

为了探究毒性机制，研究检测了氧化应激水平。DCFH-DA染色显示，苯丁锡处理组斑马鱼前体部的ROS荧光强度显著增加。在细胞水平上，流式细胞术分析也证实了总ROS和线粒体ROS的升高。同时，抗氧化基因cat（过氧化氢酶）和sod2（超氧化物歧化酶2）的表达下调，而炎症相关基因alox5a的表达上调，总抗氧化能力也出现下降。当使用抗氧化剂NAC与苯丁锡共同处理时，被抑制的体长得到了显著恢复，这直接证明了氧化应激在苯丁锡毒性中扮演了关键角色。

3.3. 苯丁锡暴露诱导细胞凋亡

丙烯橙染色显示，苯丁锡处理增加了斑马鱼特定区域（如心脏和心包区域）的细胞核荧光强度，提示细胞密度增加或凋亡发生。分子水平上，促凋亡基因casp9（半胱天冬酶9）表达上调，而抗凋亡基因bcl2和bcl-xl表达下调。TUNEL assay进一步直接证实了苯丁锡暴露导致了DNA片段化，凋亡细胞数量显著增加。这些结果说明凋亡是苯丁锡发育毒性的一个重要方面。

3.4. 苯丁锡处理引发的线粒体功能障碍

鉴于ROS产生和凋亡通路均与线粒体密切相关，研究人员深入探究了线粒体功能。Seahorse分析结果显示，苯丁锡显著降低了斑马鱼胚胎的基线呼吸、最大呼吸和ATP产量。qPCR分析发现，线粒体复合物I（ndufs3, ndufs7, mt-nd3, mt-nd4）、复合物III（uqcrh, uqcr10, mt-cyb）和复合物V（mt-atp6, atp5mea, atp5po）相关基因的表达均受到抑制。此外，利用mito:EGFP转基因鱼观察发现，苯丁锡破坏了线粒体的正常线性形态，导致其结构紊乱或聚集。蛋白质印迹显示，线粒体自噬（mitophagy）关键蛋白Pink1的表达量呈剂量依赖性增加。同时，线粒体动力学相关基因表达也发生改变：促分裂基因dnm1l（Drp1）表达上升，而促融合基因opa1和mfn2表达显著下降。这些结果表明苯丁锡不仅损害了线粒体的能量代谢功能，还破坏了其动态平衡（线粒体可塑性），导致线粒体网络趋向碎片化。

3.5. 苯丁锡暴露抑制心脏发育

基于观察到的心包水肿，研究使用cmlc2:dsRed转基因鱼评估心脏毒性。结果发现，苯丁锡暴露导致心脏尺寸和荧光强度减小。整体原位杂交显示心脏关键转录因子nkx2.5的表达模式减弱。qPCR分析也证实心脏发育相关基因cmlc1、erbb4a和erbb4b的表达下调。这表明苯丁锡干扰了斑马鱼心脏的正常发育。

3.6. 苯丁锡处理导致前部区域血管缺陷

通过fli1a:EGFP转基因鱼评估血管系统，发现苯丁锡处理组大脑区域血管荧光强度降低，而总主静脉（CCV）的尺寸异常增大。血管发育相关基因vegfaa和kdrl的表达也下降。使用gata1a:dsRed标记红细胞，发现心脏区域红色荧光信号增强，提示可能存在血液聚集和循环不畅。

3.7. 苯丁锡处理导致后部区域血管缺陷

在后部区域，fli1a:EGFP标记显示背主动脉（DA）和后主静脉（PCV）之间的分离不完全，PCV宽度增加。gata1a:dsRed信号显示后部区域血液循环出现异常。造血相关基因gata1a、gata2a和血红蛋白基因hbaa1的表达也发生改变。这些结果表明苯丁锡破坏了血管形成和血液循环。

3.8. 苯丁锡诱导的肝毒性

作为主要解毒代谢器官，肝脏的发育也受到苯丁锡影响。fabp10a:dsRed转基因鱼显示，苯丁锡暴露导致肝脏尺寸和荧光强度减小。WISH证实肝脏发育和功能相关基因fabp10a、cp（铜蓝蛋白）和prox1a的表达模式减弱。qPCR也显示fabp10a、hdac3和prox1a基因表达下调。

3.9. 苯丁锡暴露引起的胰腺毒性及胰岛素生成抑制

研究评估了苯丁锡对胰腺（代谢器官）的影响。使用elastase:EGFP（标记外分泌腺）和insulin:EGFP（标记内分泌β细胞）转基因鱼，发现苯丁锡处理降低了胰腺弹性蛋白酶和胰岛素的荧光强度及表达区域大小。WISH显示ins（胰岛素）基因表达减弱。qPCR分析发现，胰腺发育和功能相关基因，如ins、prss1（胰蛋白酶原1）、gcgra（胰高血糖素受体）、slc2a2（葡萄糖转运蛋白2）和pdx1（胰腺十二指肠同源框1）的表达均显著下调。

3.10. 苯丁锡处理引发的神经缺陷

鉴于苯丁锡的作用靶标是乙酰胆碱酯酶，研究人员评估了其神经发育毒性。使用olig2:dsRed标记运动神经元，发现苯丁锡暴露导致腹侧和背侧运动神经元轴突长度缩短。gad1b:EGFP标记的GABA能抑制性神经元在中脑区域的尺寸减小。qPCR显示多个神经发育相关基因（如olig1, olig2, huc, hud, mbp等）表达失调。

3.11. 通过NAC共处理抑制氧化应激缓解苯丁锡诱导的多器官缺陷

救援实验是本研究的关键环节。研究人员发现，与苯丁锡共同加入抗氧化剂NAC后，之前观察到的多种毒性表型得到了显著改善。这包括：恢复心脏尺寸和荧光强度（cmlc2:dsRed）；改善大脑血管荧光强度和CCV尺寸，促进DA与PCV正常分离（fli1a:EGFP）；恢复肝脏尺寸和荧光强度（fabp10a:dsRed）；缓解胰腺外分泌和内分泌细胞的发育缺陷（elastase:EGFP和insulin:EGFP）；部分恢复运动神经元轴突长度（olig2:dsRed）。这些结果强有力地证明，氧化应激是苯丁锡诱导多器官发育毒性的核心机制。

综上所述，这项研究系统性地阐明了氨基甲酸酯杀虫剂苯丁锡对斑马鱼胚胎发育的多器官毒性作用及其分子机制。研究结论指出，苯丁锡暴露通过诱发氧化应激、导致线粒体功能障碍和动力学失衡（线粒体可塑性破坏）、进而激活细胞内在凋亡通路，最终引起心血管系统、肝脏、胰腺和神经系统等多个器官的发育异常。这项研究的重要意义在于，它不仅首次在整体动物水平上全面揭示了苯丁锡的多器官毒性谱，而且明确了氧化应激在这一过程中的核心驱动作用。研究结果为了解苯丁锡对非靶标水生生物的生态风险提供了重要的毒理学依据，强调了在评估此类农药环境安全性时，考虑其系统发育毒性的必要性。同时，NAC的成功救援也为潜在的解毒策略提供了实验基础。该研究发表于《Redox Biology》，凸显了氧化还原生物学在环境毒理学研究中的重要性。