基于CRISPR/Cas12a系统的鸡传染性贫血病毒检测方法的建立

《Research in Veterinary Science》：Establishment of detection method of chicken infectious anemia virus based on CRISPR/Cas12a system

chicken infectious anemia virus (CIAV)检测技术，通过优化CRISPR/Cas12a系统结合酶促重组酶扩增（ERA），建立了高灵敏度荧光检测（1 copy/μL）和快速侧流层析检测（103 copies/μL，30分钟出结果），无交叉反应，适用于基层和资源有限地区。

　　

陈晨生|王静芳|谭梦圆|张静文|孙梦然|孙久梦|邵颖|涂健|朱良强|宋向军

中国安徽省农业大学动物科学技术学院兽医病理生物学与疾病控制重点实验室，合肥230036

摘要

鸡传染性贫血病毒（CIAV）会导致鸡传染性贫血，其特征是贫血和免疫功能障碍。该病毒的快速传播给家禽生产者带来了巨大的经济损失。

CRISPR/Cas12a系统通过crRNA引导的目标识别和Cas12a的旁分泌活性被广泛用于病毒检测。为了实现鸡传染性贫血病毒（CIAV）的快速和高灵敏度检测，我们改进了一种基于CRISPR-Cas12a的荧光检测方法。通过优化CRISPR/Cas12a系统并整合酶促重组扩增（ERA）技术，该检测方法的灵敏度达到了1拷贝/μL，显示出其在CIAV诊断中的显著实用性。此外，我们还开发并优化了一种CRISPR/Cas12a侧向流动检测方法，其灵敏度达到10^3拷贝/μL，能够快速直观地检测目标分析物。该技术对CIAV具有高度特异性，不会与其他鸡病毒发生交叉反应。总体而言，该系统使用成本效益高的设备实现了CIAV的快速检测，适用于病毒监测。

引言

鸡传染性贫血病毒（CIAV）是导致鸡传染性贫血（CIA）的病原体，对家禽养殖业构成了严重威胁（Oluwayelu等人，2005年）。该疾病表现为贫血、淋巴组织萎缩和免疫抑制，可能导致较高的死亡率。

CIAV通过垂直传播和水平传播途径扩散。感染病毒的鸡免疫力下降，容易受到二次感染，死亡率增加。过去十年中，该病毒的持续传播对亚洲经济产生了重大影响，并给家禽产业带来了严峻挑战（Daniel Todd等人，1990年；Lai等人，2013年；Vaziry等人，2011年）。目前针对CIAV的研究主要集中在遗传特征分析和进化研究上；然而，缺乏能够支持高效病毒分离的细胞系是一个关键限制，阻碍了对CIAV发病机制的系统研究。此外，有效的抗病毒策略和疫苗接种方案尚未完善，严重限制了疾病控制和预防工作。因此，本研究旨在开发一种结合高灵敏度、快速性和现场适用性的CIAV检测技术，以克服传统方法的局限性。尽管间接酶联免疫吸附试验（ELISA）能够快速检测CIAV抗体（康奈尔大学兽医学院微生物学和免疫学系，伊萨卡，2002年；Kye等人，2013年），但由于分析灵敏度不足和与相关病原体的交叉反应，其在早期诊断中的应用受到限制。因此，由于其高分析灵敏度和特异性，聚合酶链反应（PCR）和定量实时荧光PCR（qPCR）等分子诊断方法被广泛用于CIAV检测（Kato等人，2007年；Shmakov等人，2017年；Yan等人，2014年）。然而，这些方法在实地应用中受到昂贵仪器和专业技术的限制（Eisen等人，2005年；Fonfara等人，2016年；Wu等人，2020年）。这些局限性凸显了开发快速、低成本、高灵敏度的CIAV检测平台的重要性，以实现有效的病原体监测和流行病学追踪。在本研究中，我们使用CRISPR/Cas12系统进行了基于ERA的快速检测，降低了成本，并能够在偏远和经济条件较差的地区进行疾病检测（Wang等人，2020a；Yu等人，2023年）。

我们设计了针对VP2基因保守区域的特异性crRNA、探针和ERA引物。为满足快速、低成本和高灵敏度检测的需求，我们将CRISPR/Cas12a系统与酶促重组扩增（ERA）技术结合，开发了一种ERA-CRISPR/Cas12a荧光检测方法。该方法的分析灵敏度达到了1拷贝/μL，且不与其他禽类病毒发生交叉反应。为克服对复杂仪器的依赖，我们进一步结合了侧向流动条检测技术，实现了10^3拷贝/μL的灵敏度，并在30分钟内获得检测结果。总之，CRISPR/Cas12a和ERA技术的协同整合克服了传统CIAV检测方法的局限性，这些方法传统上依赖于复杂的仪器和专业技术人员（Wang等人，2020b；Wei等人，2022年）。我们评估了该方法的灵敏度、特异性和临床样本检测能力，以评估其可行性。这项研究为早期CIAV监测和流行病学调查提供了技术支持，提供了一种适用于基层和资源有限环境的时间高效、低成本的检测方法（Zhang等人，2021年）。

部分内容摘录

引物和crRNA的制备

根据制造商说明，使用TIANamp病毒DNA/RNA试剂盒（北京天根生物技术有限公司）提取病毒核酸。根据供应商的说明，将CIAV病毒的RNA基因组转化为cDNA/DNA。所得的病毒基因组cDNA/DNA储存在-80°C条件下待进一步使用。序列分析使用MegAlign软件（DNASTAR公司，美国威斯康星州麦迪逊）。

可视化ERA-Cas12a系统的构建

我们开发了基于CRISPR/Cas12a的CIAV检测系统ERA-CRISPR/Cas12a，该系统结合了荧光检测和侧向流动条读数功能。为了筛选最合适的ERA引物，对纯化的扩增产物进行了凝胶电泳分析。仅有一对引物（VP2-ERA-F2和VP2-ERA-R2）产生了明显的条带。目标片段大小为279 bp，与预期分子量一致（图1，A和B）。

讨论

CIAV的出现和快速全球传播对全球家禽产业造成了巨大损失。研究表明，CIAV感染会导致淋巴组织萎缩、免疫功能受损和潜在的死亡风险（Chen等人，2023年）。目前CIAV的管理策略受到缺乏有效疫苗和治疗干预措施的制约，使得疾病控制主要依赖于早期的分子诊断。

新颖性声明

在本研究中，我们创新性地优化了CRISPR/Cas12a系统，结合酶促重组扩增（ERA）技术用于鸡传染性贫血病毒（CIAV）的诊断，并在此基础上建立了CRISPR/Cas12a荧光检测方法和CRISPR/Cas12a侧向流动条检测方法。此外，我们确认该技术与其他鸡病毒无交叉反应，表明其具有良好的特异性。

作者贡献声明

陈晨生：撰写初稿、研究、数据管理。王静芳：撰写初稿、研究、数据管理。谭梦圆：研究、数据管理。张静文：撰写初稿、数据管理。孙梦然：研究、数据管理。孙久梦：撰写、审稿与编辑。邵颖：撰写、审稿与编辑。涂健：撰写、审稿与编辑。朱良强：撰写、审稿与编辑。宋向军：撰写、审稿与编辑。

利益冲突声明

伦理批准和参与同意：本研究未使用活体动物。利益声明：无。科学写作中未使用生成式AI。

致谢

本工作得到了IHM食品营养与健康联合研究中心研究基金（2024SJY04）和安徽省优秀青年人才支持计划（YQYB2023001）的资助。