《Epigenetics》：Silencing of optogenetic and chemogenetic transgenes in human iPSCs involves promoter methylation and methylation-independent mechanisms
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本研究揭示了在诱导多能干细胞（iPSCs）中，利用CRISPR/Cas9和PiggyBac系统整合光遗传学（ChR2）和化学遗传学（hM4Di）受体基因后，尽管基因组整合成功，但目标蛋白表达却完全沉默。研究证实，这种沉默主要由外源启动子（如TRE3G BI、CMV、EF1α）的高甲基化驱动，且该过程具有整合位点依赖性。值得注意的是，即使在低甲基化克隆中，基因表达依然缺失，提示存在组蛋白修饰等甲基化非依赖性机制。此外，iPSCs向神经干细胞（NSCs）的分化过程无法逆转启动子甲基化状态，表明这种表观遗传沉默具有稳定性。该研究为优化iPSCs基因编辑策略提供了关键见解。
成功构建CRISPR-Cas9系统介导的ChR2和hM4Di基因修饰iPSCs
为了在细胞中条件性诱导光遗传学受体通道视紫红质-2（ChR2）和化学遗传学受体hM4Di的表达，研究团队首先选用了CRISPR/Cas9基因编辑系统。他们构建了一个供体质粒AAVS1-3G-puro-tetOn-ChR2-hM4Di，该质粒利用多西环素（Dox）诱导的TRE3G启动子驱动ChR2和hM4Di的表达，并通过同源臂靶向整合至基因组AAVS1安全港位点。
在HEK293T细胞中验证该系统的有效性时，研究人员发现，无论是1 μg/mL还是2 μg/mL的Dox均能有效诱导mCherry荧光蛋白的表达。通过蛋白质印迹（Western blot）分析，使用抗HA抗体检测到HA标签的目标蛋白在Dox诱导下成功表达，证实了供体质粒构建成功。
随后，研究团队将供体质粒与AAVS1 gRNA全合一CRISPR/Cas9质粒共转染至iPSCs中，并通过嘌呤霉素筛选获得阳性细胞。通过连接PCR（junction PCR）对单细胞克隆进行基因型鉴定，结果显示克隆103、104、106、108、111、112、116和117均为阳性克隆，其中克隆104为纯合子，其余为杂合子。这些结果证明了光化学遗传受体基因已成功整合至iPSCs的AAVS1位点。
基因修饰iPSCs中目标蛋白表达缺失
为了验证阳性iPSC克隆的蛋白表达情况，研究人员选取了iPSCs-104、iPSCs-106和iPSCs-112三个细胞克隆进行检测。结果显示，在Dox诱导后，这些细胞中均未观察到mCherry荧光蛋白的表达。通过蛋白质印迹分析进一步确认，这三个iPSC细胞系中均未检测到HA标签的表达，而HEK-293T阳性对照细胞中则检测到了HA信号。这些结果表明，整合至AAVS1位点的Tet-On调控的ChR2和hM4Di基因在iPSCs中未能成功表达。
整合至iPSCs基因组的TRE3G双向启动子发生高甲基化
启动子序列的甲基化是影响基因表达的重要因素。为了探究AAVS1位点整合的Tet-on调控基因在iPSCs中表达失败的原因，研究人员针对TRE3G双向启动子（TRE3G BI）序列设计了甲基化特异性引物，并通过亚硫酸氢盐甲基化PCR（bisulfite methylation PCR）和TA克隆测序分析了其甲基化水平。
结果显示，在HEK293T细胞中，TRE3G BI启动子几乎未发生甲基化，甲基化水平约为5.9%。然而，在选定的iPSCs-104、iPSCs-106和iPSCs-112细胞中，TRE3G BI启动子的甲基化水平分别高达95.3%、98.2%和98.2%。值得注意的是，使用DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨（decitabine）处理后，由TRE3G BI启动子驱动的ChR2表达显著增强，而由内源性AAVS1启动子控制的PuroR表达则保持不变。这些结果表明，整合至AAVS1位点的ChR2和hM4Di基因的TRE3G BI启动子在iPSCs中发生了高甲基化，这可能是导致蛋白表达检测失败的原因。
基于PiggyBac转座子系统的基因修饰iPSC克隆未能表达目标蛋白
由于AAVS1位点整合基因的启动子在iPSCs中发生高甲基化，导致目标基因无法正常表达，研究团队随后尝试使用PiggyBac转座子系统，将ChR2和hM4Di基因片段随机整合至基因组的TTAA位点，以探究插入基因在iPSCs中是否能够表达。
为此，他们构建了PiggyBac-ChR2-hM4Di质粒。在HEK293T细胞中验证该系统有效性时，共转染PiggyBac-ChR2-hM4Di和PiggyBac转座酶质粒后，通过嘌呤霉素筛选获得了表达CoGFP的细胞，并通过蛋白质印迹分析检测到了HA标签目标蛋白的表达，表明基于PiggyBac转座子的ChR2和hM4Di表达系统构建成功。
为了确定PiggyBac转座子系统在iPSCs中的蛋白表达情况，研究人员将PiggyBac-ChR2-hM4Di和PiggyBac转座酶质粒共转染至iPSCs中，筛选获得了四个阳性iPSC克隆。结果显示，阳性iPSCs中可见CoGFP表达，表明目标基因已整合入iPSC基因组。然而，蛋白质印迹分析显示，这四个iPSC克隆中均未检测到HA标签蛋白。在iPSCs传代过程中，研究人员发现CoGFP表达出现部分沉默。流式细胞术分析显示，CoGFP阳性细胞的比例逐渐减少。值得注意的是，使用更高浓度的嘌呤霉素处理，CoGFP阳性细胞的比例显著增加，但阳性率在所有实验组中均低于95%，表明在iPSCs传代过程中，插入基因的表达逐渐失活。上述结果表明，整合至TTAA位点的ChR2和hM4Di基因在iPSCs中无法正常表达。
外源基因在iPSCs中的表达受启动子甲基化和甲基化非依赖性调控机制共同调节
为了探究基因修饰iPSC克隆中外源启动子的甲基化水平，研究人员针对CMV和EF1α启动子设计了甲基化引物，并通过亚硫酸氢盐甲基化PCR和测序进行了分析。
结果显示，在HEK293T细胞中，CMV启动子的甲基化水平极低（约0.9%），而EF1α启动子的甲基化水平约为71.7%。尽管HEK293T细胞中EF1α启动子甲基化水平较高，但下游的CoGFP基因仍成功表达，这可能是由于CoGFP基因由EF1α核心启动子和人T细胞白血病病毒1型（HTLV-1）截短的5'长末端重复序列（5'LTR）共同驱动，在EF1α启动子高甲基化的情况下，5'LTR可能启动CoGFP表达。
在PiggyBac-iPSCs-1细胞中，CMV启动子的甲基化水平为0%，而EF1α启动子的甲基化水平为41.9%。在PiggyBac-iPSCs-5克隆中，CMV和EF1α启动子的甲基化水平分别高达92.6%和95.2%。这些结果揭示了iPSC中外源启动子的甲基化水平具有整合位点依赖性。
为了进一步研究启动子甲基化在转基因沉默中的作用，研究人员用不同浓度的地西他滨处理携带高甲基化启动子的PiggyBac-iPSCs-5克隆。结果显示，PuroR和ChR2的表达均上调，尤其是在10 μM浓度下，表明DNA甲基化参与了整合转基因的转录抑制。
考虑到在PiggyBac-iPSCs-1（CMV启动子低甲基化）和PiggyBac-iPSCs-5（CMV启动子高甲基化）克隆中均未检测到目标蛋白，这些发现表明，iPSCs中的转基因表达不仅受启动子甲基化水平的调节，还受其他调控因子的影响，例如内在启动子强度。上述结果进一步证实，iPSCs中的外源基因表达不仅受启动子甲基化水平的调控，还受iPSCs内甲基化非依赖性调控机制的调控。
iPSCs向神经干细胞分化未能逆转外源启动子的甲基化水平
研究表明，表观遗传诱导的基因沉默是可以逆转的。为了探究iPSCs向神经干细胞（NSCs）分化后启动子甲基化程度是否发生变化，研究人员将AAVS1-iPSCs-104和PiggyBac-iPSCs-5两个iPSC细胞系诱导分化为神经干细胞。分化后的细胞表达了神经干细胞标志物NESTIN和PAX6。
随后，研究人员分析了分化细胞中外源启动子的甲基化水平。结果显示，AAVS1-iPSCs-104来源的神经干细胞中，TRE3G BI启动子的甲基化水平为97.6%；PiggyBac-iPSCs-5来源的神经干细胞中，EF1α启动子和CMV启动子的甲基化水平分别为94.4%和91.7%。这些结果与未分化iPSCs中的发现一致，表明iPSCs分化无法逆转外源启动子的甲基化。研究人员进一步检测了iPSC来源的NSCs中HA标签蛋白的表达，结果显示神经干细胞中未检测到HA标签表达。上述结果揭示，iPSCs分化无法逆转外源启动子的启动子甲基化。
