《Gut Microbes》：Targeting the microbiome in pediatric migraine: gastrointestinal manifestations and the therapeutic role of Bifidobacterium longum
摘要
偏头痛是一种致残性神经系统疾病，常始于儿童期或青春期，并频繁伴随胃肠道症状。然而，关于儿童偏头痛，特别是合并胃肠道疾病患者的微生物群特征和肠-脑相互作用仍不明确。本研究旨在探讨儿童偏头痛的临床和微生物特征，以及益生菌的治疗潜力。
研究前瞻性招募了126名伴有或不伴有胃肠道疾病的儿童偏头痛患者（年龄6-19岁）和50名年龄匹配的健康对照。采用16S rRNA测序对粪便微生物群进行分析。根据罗马IV标准定义的胃肠道疾病对偏头痛患者进行分层，并评估其头痛特征、PedMIDAS评分（残疾评估）、血浆降钙素基因相关肽（CGRP，被认为是偏头痛的关键生物标志物）、细胞因子和粪便钙卫蛋白。在幼年（3-4周）和成年辣椒素诱导的偏头痛大鼠模型中测试了益生菌的效果，并开展了一项涉及23名儿童偏头痛患者的探索性先导研究。
与对照组相比，偏头痛患者表现出独特的肠道微生物群，其特征是长双歧杆菌减少和拟杆菌属增加。46.8%的偏头痛患者存在胃肠道疾病，这些患者腹痛发生率（50% vs. 13%, p< 0.001）、偏头痛相关残疾程度（PedMIDAS: 60 ± 13.2 vs. 29 ± 7.0, p= 0.042）、粪便钙卫蛋白水平以及牛链球菌的富集均显著更高。相比之下，与长双歧杆菌呈正相关的普拉梭菌，在无胃肠道疾病的偏头痛患者中与较轻症状和较短病程相关。在动物模型中，长双歧杆菌在幼年和成年大鼠中均能减弱三叉神经激活。探索性先导研究表明，补充长双歧杆菌可减少头痛天数、强度和频率。这些发现揭示了儿童偏头痛中独特的肠道微生物特征，并确定长双歧杆菌是一种有前景的微生物靶向治疗策略。我们的工作凸显了在儿童偏头痛中调节肠-脑轴的治疗潜力。
引言
偏头痛是一种复杂的神经系统疾病，以反复发作的、通常致残的头痛为特征，伴有对光、声和运动的敏感性增高。它仍然是全球范围内导致残疾的最普遍原因之一。当前的模型表明，偏头痛的发生涉及一系列级联反应，包括外周三叉神经血管系统（如三叉神经节）的激活、神经源性炎症以及随后中枢疼痛通路（如三叉神经颈复合体）的敏化。降钙素基因相关肽（CGRP）是这一过程中的关键神经肽，有助于血管舒张和炎症信号传导。偏头痛患者血浆和脑脊液中CGRP水平升高，尤其是在急性发作期间。
越来越多的证据表明偏头痛与胃肠道疾病之间存在强关联，包括功能性消化不良、肠易激综合征和腹型偏头痛，甚至包括婴儿肠绞痛等早年期状况。这些重叠现象提示存在以内脏高敏感性和神经免疫相互作用为中心的共享病理生理机制，涉及血清素、CGRP和炎症细胞因子等因素。肠道微生物群已成为脑-肠通信的关键参与者，影响免疫功能、肠道通透性和神经活性代谢物的产生。肠道通透性增加和炎症反应，可能由促炎细胞因子（如肿瘤坏死因子-α）、未消化的食物颗粒以及细菌代谢物或内毒素介导，可能作用于三叉神经血管系统，从而引发偏头痛样发作。微生物代谢物，如短链脂肪酸、血清素和多巴胺，可以进一步通过肠神经系统和中枢神经系统传递信号，从而调节大脑功能。生命早期微生物群的发展也塑造了长期的免疫和神经结局。尽管存在这些联系，肠道微生物群在儿童偏头痛中的作用，特别是与胃肠道疾病相关的方面，仍然知之甚少，尚未得到系统表征。
临床前偏头痛模型，包括硝酸甘油诱导的痛觉过敏、皮质扩散性抑郁和辣椒素诱导的三叉神经血管激活，再现了该疾病的核心特征，如CGRP释放、神经元敏化和偏头痛样疼痛行为。这些模型对既定抗偏头痛治疗的反应性支持了其转化相关性。这些模型最近已被扩展到研究肠-脑轴，其中通过抗生素、益生菌或粪便微生物群移植操纵肠道微生物群已被证明可以调节偏头痛样表型。硝酸甘油及相关模型中的微生物组和代谢组分析进一步揭示了分类群和代谢物水平的改变，如短链脂肪酸和色氨酸途径。这些变化反映了患者的发现，并强调了这些模型在研究肠道菌群失调与偏头痛病理生理学联系方面的效用。
我们假设肠道菌群失调有助于偏头痛的发病机制，而微生物组调节可能恢复其有害影响。为了验证这一点，我们进行了一项结合临床和微生物分析的前瞻性研究，以及一项探索性先导研究。
方法
研究对象
我们前瞻性招募了2019年7月至2023年10月期间在台湾大学医院（台湾的一家三级医疗中心）儿科神经科门诊或病房就诊的126名年龄在6-19岁之间被诊断为偏头痛的患者。偏头痛的诊断依据国际头痛协会头痛分类委员会2013年的标准。所有入组受试者均接受彻底的临床评估和记录，包括年龄、性别、发病年龄、头痛特征（强度0-10分）、持续时间、频率、诱因和偏头痛家族史。使用儿童偏头痛残疾评估量表评估偏头痛致残情况。招募了50名年龄匹配的健康对照，他们无头痛史或慢性内科、神经或精神疾病。如果患者或对照在过去两周内接受过抗生素治疗、过去一个月内接受过益生菌治疗，或患有多发先天性异常或智力残疾，则被排除在外。
为了区分伴有或不伴有胃肠道疾病的偏头痛患者，我们记录了所有患者的胃肠道症状。伴有胃肠道疾病的偏头痛患者定义为根据国际头痛协会2013年标准临床诊断为偏头痛，加上根据罗马IV诊断标准诊断为功能性消化不良、肠易激综合征或腹型偏头痛等胃肠道疾病。本研究经台湾大学医院机构审查委员会批准，并获得知情同意。
样本收集
在126名偏头痛患者中，入组后收集了血液（n = 107）和粪便材料（n = 119）。用于微生物组分析的粪便样本采集自50名年龄匹配的儿科健康对照。在126名入组的偏头痛患者中，有31名受试者收集了配对的粪便和血液样本，并与症状明确关联：在发作间期和头痛发作期，且无症状间隔至少一周。
粪便微生物组分析
16S rRNA基因扩增和文库构建
使用QIAamp PowerFecal Pro DNA试剂盒从偏头痛患者的粪便样本中提取DNA。通过PCR扩增细菌16S核糖体RNA基因的V3-V4高变区；并按照Illumina文库构建方案制备16S V3-V4扩增子文库。
基于MiSeq的高通量测序和数据分析
使用Illumina MiSeq平台的paired-end 2 × 300 bp对文库进行测序。使用QIIME 2插件内的DADA2对原始FASTQ文件进行去噪。基于EZBiocloud数据库对去噪后的扩增子序列变体（ASV）进行分类。使用QIIME2插件core-metrics-phylogenetic绘制β多样性结果图，并使用MicrobiomeAnalyst网络工具进行LEfSe分析。
血浆CGRP和细胞因子水平的测量
将入组患者的血浆样本保存在–80°C，并进一步用于测量CGRP、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、前列腺素E2、白细胞介素6和核因子κB水平，使用ELISA试剂盒。粪便样本也通过ELISA测量钙卫蛋白。进行测量的个体对受试者的身份、发作状态和治疗分组不知情。
辣椒素诱导的偏头痛模拟大鼠模型
所有动物护理和实验方案均经台湾大学医学院机构动物护理和使用委员会批准。使用7-8周龄（226-275克）和3-4周龄（76-125克）的雄性Wistar大鼠。排除雌性大鼠，因为性激素是偏头痛的重要混杂因素。分组分配对所有人员保密，分配者除外。在实验、结果评估和数据分析过程中保持盲法以最小化偏倚。所有动物实验均遵循了相关的伦理指南和法规。大鼠饲养在温度可控的设施中，12小时光/暗循环，自由获取标准饲料、水和用于啃咬的木棍。每笼饲养三只动物，并根据标准化程序清洁笼子。
大鼠通过口服灌胃预先给予益生菌长双歧杆菌（3 × 109菌落形成单位）或含有两歧双歧杆菌（109CFU）和嗜酸乳杆菌（109CFU）的多菌种益生菌产品（缩写为BbLa，作为长双歧杆菌阴性益生菌对照）两周。幼年组益生菌剂量减半。在未治疗组中，大鼠每日通过口服灌胃给予水，持续两周。按照既定方案，通过小脑延髓池内滴注辣椒素诱导大鼠的三叉神经血管激活。大鼠用乌拉坦麻醉，并进行导管插入，将辣椒素（10 nmol, 100 μl）在1分钟内注入小脑延髓池。通过将大鼠置于-30度位置30分钟，随后俯卧位90分钟以促进分布。假手术组大鼠仅接受载体。滴注后两小时，处死大鼠并通过升主动脉灌注4%多聚甲醛用于免疫组化染色。结果测量包括TCC中的c-Fos免疫反应神经元和TG中的CGRP免疫反应神经元，所有指标均明确定义并标准化以确保一致性。
TCC组织切片中c-Fos蛋白的免疫组化分析
TCC切片制备和c-Fos特异性免疫组化按照既定方法完成。从距离闩部头端1mm处开始，直至脊髓C6节段，连续切片（50 μm）。对距离闩部+0.6、-1.2和-9 mm处的切片进行c-Fos抗体免疫染色。使用先前推导的公式估算c-Fos免疫反应性TCC神经元的总数。
使用亲和素-生物素法进行c-Fos蛋白的游离漂浮免疫组化，遵循既定方案。使用兔多克隆抗c-Fos抗体、生物素化的抗兔IgG和辣根过氧化物酶标记的亲和素D进行检测。使用DAB试剂盒可视化免疫反应信号，并使用显微镜计数c-Fos免疫反应神经元。数据分析由对治疗组不知情的研究人员进行。
TG切片中CGRP的免疫荧光
TG切片制备和CGRP免疫荧光定量遵循既定方法。每只大鼠解剖两个TG组织，使用切片机以50 μm厚度切片。每个神经节取9个切片，每第三个切片用于CGRP免疫荧光。切片与兔抗CGRP一抗孵育，然后与荧光素标记的山羊抗兔IgG二抗孵育。使用倒置荧光显微镜捕获图像，并使用ImageJ软件在100倍放大倍数下分析CGRP表达强度。分析基于每张图像中的光密度乘以激活区域。
药物
从Sigma Chemical购买的辣椒素溶解在含有10%乙醇和10% Tween 80的载体中，超声处理5分钟，然后在人工脑脊液中进一步稀释（1:100）制成储备液，于4°C保存。
小鼠粪便中的16S rRNA微生物组分析
在麻醉进行手术程序前，将粪便样本收集到灭菌的1.7 mL共聚物微量管中，并在收集后4小时内于-80°C保存。使用QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit提取DNA。使用Qubit荧光计定量DNA浓度，并使用与偏头痛患者样本相同的方案制备16S rRNA V3–V4测序文库。
评估长双歧杆菌临床益处的探索性先导研究
在一项探索性随机双盲先导研究中评估了长双歧杆菌的效果，该研究评估了在2023年1月至2025年2月期间符合ICHD-3标准的偏头痛患者使用益生菌的可行性。该研究经台湾大学医院研究伦理委员会批准。获得了每位患者及儿科患者父母签署的知情同意书。参与者被随机分配（3:1）服用长双歧杆菌或含有两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的制剂（后者作为对照组），使用计算机生成的序列。使用按顺序编号的密封信封隐藏分配。参与者每天摄入两种益生菌产品之一，持续12周。在研究期间，患者坚持写每日头痛日记，记录疼痛评分（0-10分）、头痛频率和每周头痛天数。
统计分析
使用正态性检验评估数据假设，对于连续变量和方差齐性。如果假设被违反，则酌情应用非参数检验。数据表示为平均值±标准误，除非另有说明。所有分类变量均使用卡方检验或Fisher精确检验进行分析。p值<0.05被认为具有统计学意义。使用SPSS进行统计分析。使用线性判别分析效应大小来识别最能区分组别的特定微生物。LDA得分>4定义为显著丰度。使用R中的lme4包拟合线性混合效应模型以估计最小二乘均值。使用emmeans包估计LS均值。
结果
偏头痛发病机制中涉及的独特微生物群特征
研究人群
为了探讨肠道微生物群对偏头痛发病机制的影响，本研究招募了126名偏头痛患者和50名年龄匹配的健康对照。根据临床表现，将偏头痛患者分为伴有胃肠道疾病（n = 59）和不伴有胃肠道疾病（n = 67）的亚组。对患者进行了至少6个月的随访，并在研究期间于发作期和非发作期收集粪便样本。
偏头痛相关分类群的鉴定
在微生物群分析中，我们观察到偏头痛组和健康对照组之间的α多样性（如ASV水平的Shannon和Chao1指数所示）无显著差异，表明两组间丰富度相似。值得注意的是，基于Bray–Curtis距离矩阵的主坐标分析（PCoA）识别出β多样性差异，显示偏头痛样本与健康对照样本明显分离，突出了在偏头痛应激下细菌组成的变异性。
为了识别偏头痛相关分类群，采用LEfSe生成簇状图，说明组间差异细菌属和种。发现如Blautia、Bifidobacterium和Eubacterium等菌属在健康对照中丰富，而Parabacteroides和Bacteroides在偏头痛患者中富集。
在进一步的物种鉴定中，LEfSe显示长双歧杆菌和Fusicatenibacter saccharivorans是区分健康对照与偏头痛患者的主要细菌。此外，Bacteroides dorei、Bacteroides plebeius、Bacteroides uniformis、Bacteroides stercoris和Parabacteroides merdae在偏头痛患者中过度代表。点图进一步说明了这些显著差异。
长双歧杆菌在健康对照中的定植显著高于偏头痛患者，提示补充长双歧杆菌有潜力重建偏头痛患者失调的肠道微生物群。尽管健康对照中F. saccharivorans的水平比偏头痛患者更丰富，但其益生菌作用仍知之甚少。
长双歧杆菌改善辣椒素诱导的偏头痛大鼠模型疼痛
辣椒素诱导的偏头痛大鼠模型
为了测试长双歧杆菌给药是否能改善偏头痛，建立了一个相关的偏头痛大鼠模型。雄性Wistar大鼠（成年7-8周，幼年3-4周）在小脑延髓池内给予辣椒素前，每日通过口服灌胃给予长双歧杆菌或含有BbLa的益生菌对照，持续2周。这种辣椒素诱导的偏头痛模拟大鼠模型已通过增加TCC神经元中c-fos的免疫反应性和TG中CGRP得到很好的表征。
值得注意的是，饲喂长双歧杆菌显著减少了TCC中c-fos和TG中CGRP的免疫反应神经元。这一发现在幼年和成年大鼠模型中均可重复，表明长双歧杆菌具有抗偏头痛作用。
长双歧杆菌治疗改变肠道微生物群组成
探究长双歧杆菌如何阻断辣椒素激活的偏头痛疼痛至关重要。我们假设长双歧杆菌诱导的肠道微生物群重建可以预防或减轻偏头痛疼痛。因此，我们分析了上述偏头痛大鼠模型的肠道微生物群构成。在麻醉进行手术程序前收集它们的粪便样本，并通过16S rRNA NGS分析揭示肠道微生物群。基于Bray–Curtis方法的PCoA分析显示，在幼年和成年大鼠中，载体、长双歧杆菌和BbLa喂养组之间存在显著的聚类。
长双歧杆菌反应中差异丰富的属
采用LDA得分对数至少4的阈值来判别特征。在属水平上，Akkermansia和Parabacteroides分别在幼年和成年偏头痛大鼠中具有最高的LDA得分。与载体治疗相比，饲喂长双歧杆菌导致幼年和成年大鼠中双歧杆菌水平升高。
值得注意的是，幼年和成年大鼠中双歧杆菌的丰度与Parabacteroides呈负相关，而Parabacteroides在偏头痛患者中高度定植，提示双歧杆菌可能阻碍偏头痛相关的Parabacteroides的生长，并改善宿主肠道中的微生物平衡。重要的是，在幼年和成年大鼠中，双歧杆菌的丰度与Faecalibaculum水平呈正相关。
与神经元活动的相关性
此外，幼年和成年大鼠粪便中双歧杆菌的水平与TCC中c-fos免疫反应神经元的数量呈显著负相关（Spearman r = -0.7762, p = 0.0043），进一步强调了长双歧杆菌潜在的抗偏头痛作用。
伴有和不伴有胃肠道疾病的偏头痛患者肠道微生物群差异
伴有和不伴有胃肠道疾病的偏头痛患者的临床特征
在126名偏头痛患者中，我们发现59名患者（46.8%）被指定为伴有胃肠道疾病组（M+G），而67名（53.2%）为不伴有胃肠道疾病组（M+noG）。M+G组与M+noG组在年龄、性别、发病持续时间、疼痛评分和使用的药物方面没有差异。使用的药物包括抗偏头痛药、维生素和抗过敏药。腹痛显著区分了伴有胃肠道疾病的偏头痛患者与不伴有者（50% vs. 13%, p < 0.001），而恶心/呕吐在两组中都很普遍（57% vs. 59%, p = 0.861）。伴有胃肠道疾病的患者具有更高的PedMIDAS评分（60 ± 13.2 vs. 29 ± 7.0, p = 0.042）。
与胃肠道共病相关的独特细菌分类群
我们进一步比较了M+G和M+noG患者之间的肠道微生物群谱。Shannon（p < 0.03）和Chao1指数显示M+noG患者粪便样本中肠道微生物群的丰富度增加。
在LEfSe分析中，牛链球菌在M+G患者中富集，而M+noG患者倾向于显示更高水平的普拉梭菌、Fusicatenibacter saccharivorans等。尽管这些发现在FDR校正后未达到显著性，但我们注意到几个具有潜在生物学相关性的关联。特别是，M+G患者中牛链球菌的存在与更高的PedMIDAS评分相关（Spearman r = 0.4679, p < 0.007），提示这种细菌与更严重的临床表现可能存在联系。
尽管M+G和M+noG患者之间的肠道微生物群谱显著不同，但偏头痛标志物（CGRP和PGE2）的血浆水平和炎症指标（IL-1β、IL-6、NF-κB、TNF-α）没有差异。这强调了肠道微生物群在区分两组患者中的作用。
普拉梭菌的保护作用
在M+noG组患者中，普拉梭菌与降低的疼痛评分（Spearman r = -0.4814, p < 0.0003）和缩短的疾病持续时间（Spearman r = -0.3989, p < 0.004）显著相关。表现出较高普拉梭菌水平的M+noG患者，其肠道炎症较轻。他们的粪便钙卫蛋白水平显著低于M+G患者（p < 0.02），并与健康对照相当。所有这些发现表明普拉梭菌在偏头痛管理中具有潜在作用。
重要的是，M+noG患者中普拉梭菌的生长与长双歧杆菌的丰富度强烈且显著相关（Spearman r = 0.5731, p < 0.0003），表明长双歧杆菌可能参与调节普拉梭菌。来自偏头痛大鼠模型的观察结果进一步支持了这一发现。在幼年和成年大鼠中，响应长双歧杆菌补充，双歧杆菌和Faecalibaculum水平之间建立了正相关关系，提示这些细菌可能协同作用以对抗人类和大鼠的偏头痛发作。
长双歧杆菌和普拉梭菌与更好的临床评分相关
为了验证上述假设，我们特别使用Spearman相关系数分析研究了长双歧杆菌和普拉梭菌在偏头痛患者发作期的重要性。在M+noG患者中，观察到长双歧杆菌与疼痛评分（Spearman r = -0.3956, p < 0.03）以及疾病持续时间（Spearman r = -0.5214, p < 0.002）之间存在显著的负相关，与观察到的普拉梭菌的关联相似。此外，F. saccharivorans进一步促进了M+noG和M+G患者疾病持续时间和疼痛评分的负相关。结合普拉梭菌、长双歧杆菌和F. saccharivorans的效应，观察到M+noG患者的疼痛评分和疾病持续时间呈下降趋势，与M+G患者相比。尽管普拉梭菌和F. saccharivorans有助于降低M+G患者的疼痛评分，但由于缺乏长双歧杆菌的参与，它们无法达到在M+noG患者中观察到的降低水平。
此外，M+noG患者中长双歧杆菌的生长在非发作间隔期更快，但在过渡到发作期后显著减少。这表明维持高水平的长双歧杆菌对于预防胃肠道表现甚至偏头痛发作的重要性。
与不良预后相关的致病菌种
另一方面，如B. dorei, B. plebeius, B. uniformis, B. stercoris和P. merdae等细菌在偏头痛患者中更丰富，并且与更差的临床结果呈正相关，包括更高的PedMIDAS评分、更频繁的发作和升高的钙卫蛋白水平。这些关联提示它们在偏头痛发作中具有潜在的致病作用。
长双歧杆菌似乎减轻儿童偏头痛患者的头痛负担
研究对象
在我们的探索性先导研究中，17名偏头痛患者（9名女性）接受长双歧杆菌（BL）治疗，6名（3名女性）接受两歧双歧杆菌/嗜酸乳杆菌（Bb
