《Biochemical and Biophysical Research Communications》：MCAO Rat Model-Guided Identification of Crucial miRNAs and Stroke-Related Networks via High-Throughput Sequencing
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通过建立MCAO大鼠模型，结合深度测序和qRT-PCR验证，发现miR-398、miR-544、miR-1808等3个新miRNA及10个已知miRNA，其靶基因涉及氧化应激、细胞凋亡、炎症反应和神经再生等病理过程，揭示了miRNA-mRNA调控网络在脑缺血再灌注损伤中的关键作用，为卒中治疗提供新靶点。
江武|杨玉英|袁珊|胡光泽|高瑞|甘尚全
广东海洋大学海岸农业科学学院，中国湛江524088
摘要
缺血性中风是一种复杂的多基因疾病，微小RNA（miRNAs）在各种生理和病理过程中起着重要作用。然而，涉及大脑miRNAs在中风发展中的具体调控网络和机制仍不甚明确。在本研究中，我们建立了Sprague-Dawley大鼠的中脑动脉阻塞（MCAO）模型来模拟脑缺血。通过深度测序技术分析了中风后大脑皮层中的miRNA表达情况，重点识别关键miRNAs。通过定量逆转录PCR（qRT-PCR）验证了差异表达的miRNAs（DEMis）及其潜在的目标mRNAs，结果与测序结果高度一致。聚类分析显示MCAO组和对照组大脑皮层组织之间的miRNA表达模式存在显著差异。基因本体论（GO）富集分析表明，DEMis的目标基因与中风相关通路显著相关，包括钙跨膜转运、轴突导向以及MAPK和PI3K信号通路。此外，通过将DEMis的目标基因与高通量测序得到的差异表达基因（DEGs）相结合，我们鉴定了376个与疾病相关的目标基因，并构建了关键DEGs的miRNA-mRNA调控网络。通过这一分析，我们发现了3个新的miRNAs（novel-miR-398、novel-miR-544和novel-miR-1808）以及之前在中风或其他疾病中报道过的10个miRNAs。这些miRNAs的目标基因通过内源性竞争机制参与了中风后的氧化应激、细胞凋亡、炎症反应和神经再生等过程。我们的发现表明，miRNAs在调节中风后的病理生理过程中起着重要作用，为治疗干预提供了潜在的新靶点，并加深了我们对中风分子机制的理解。
引言
缺血性中风是全球导致高死亡率和残疾的主要原因[1]，且治愈后的复发率很高，这可能对患者的生活质量造成严重影响。缺血性中风，也称为局灶性脑缺血，通常是由脑血管血栓栓塞或动脉粥样硬化引起的血管阻塞所致。脑组织具有较高的代谢活性和较低水平的保护性抗氧化酶，因此在身体缺血时，脑成为最敏感的器官[2]，[3]。在中风窗口期内进行溶栓治疗是一种临床公认的方法，但在确保组织血流再灌注的同时减少缺血组织的损伤是一个医学挑战[4]。关于脑缺血-再灌注损伤的机制有很多理论，其发生和发展是复杂的生理过程，包括：氧化应激、血脑屏障（BBB）破坏、兴奋性氨基酸（EAA）的细胞毒性、离子水平失衡、线粒体功能障碍、炎症反应、自噬现象[5]，[6]等。这些损伤机制大多是独立的平行通路，但也存在前馈、反馈和相互作用循环。例如，在中风再灌注损伤后，氧化应激水平升高，会导致BBB破坏，并可能促进神经元凋亡。凋亡细胞中的线粒体功能障碍会增加活性氧的含量，进一步加剧氧化应激[7]。在这一系列病理过程中，许多生物分子之间的相互作用在不同时间和不同层次上形成了大量的复杂级联网络。这种生物级联网络为缺血性中风等复杂疾病提供了新的视角：多个病理通路通过相互交织的生物级联网络在不同时间和不同分子水平上相互作用和平衡，从而影响疾病的病理生理过程[8]，[9]。因此，研究中风后损伤相关的生物级联网络有助于我们更全面地理解中风的病理生理过程，并为从多个靶点探索复杂疾病的进展提供了新的方向。
miRNA是一种无编码能力的单链RNA[10]，长度通常为21-25个核苷酸（nt）。它主要在转录后水平调节基因表达，在人体等许多生物体中广泛存在。miRNA可以结合目标mRNA的3'-非翻译区（3'-UTR），通过抑制翻译发挥调控作用，最终抑制目标基因的表达[11]。研究发现，miRNAs几乎参与了体内的所有病理生理过程，如个体生长发育、细胞增殖和分化、炎症反应、氧化应激和神经退行性疾病[12]，[13]。越来越多的证据表明，miRNAs被外泌体摄取并随外泌体循环进入外周循环，或在细胞间传递，循环中的miRNAs可用作包括中风在内的多种疾病的诊断和预后生物标志物[14]。先前在啮齿动物MCAO模型中的研究表明，缺血后脑组织中的miRNA表达发生了改变，类似地，中风患者的循环miRNAs也表现出失调，支持了它们在中风病理学中的潜在作用[15]。最近一项研究分析了急性缺血性中风患者血清来源的细胞外囊泡，发现了差异表达的miRNA特征，进一步突显了细胞外囊泡miRNAs作为中风诊断和预后生物标志物的相关性[16]。miRNAs在脑组织中富集，可以在缺血性中风后以转录后方式调节潜在有害基因的表达。同时，miRNAs可以调节特定蛋白质的表达，促进神经保护和血管生成，从而促进急性中风患者的恢复和修复[17]。例如，中枢神经系统中的miR-124表达量是其他器官的数百倍，它在神经元生长和分化中起着重要作用[18]。这些特性使其在神经系统疾病的诊断和治疗中具有潜在的应用价值。
迄今为止，越来越多的实验表明miRNAs参与了脑缺血-再灌注损伤（CIRI）的进展[19]，[20]，[21]，[22]。某些miRNAs在中风后具有显著的神经保护作用，例如miR-29b，在过表达时可以有效减少缺血性中风引起的BBB破坏[23]。miRNAs在CIRI发病机制中的调控作用显而易见。研究表明，miRNAs不仅可以调节缺血性脑损伤期间的神经血管发生和血管炎症过程，还可以调节CIRI期间的脑水肿程度以及参与缺氧应激和细胞凋亡的调节[24]，[25]。例如，miR-181a在脑组织中高度富集，并在中风后上调[19]。研究显示，miR-181a通过靶向单核细胞和巨噬细胞介导的IL1a发挥抗炎作用[20]。同样，miR-335可以靶向并调节Hif-1α，通过调节VEGFA、ANGPT2等因子改变脑血管通透性，从而加剧CIRI期间的脑水肿[21]。总之，miRNAs参与了中风后的病理和生理过程，并在其中发挥重要作用。因此，筛选尽可能多的可能参与CIRI过程的miRNAs对于理解CIRI的发病机制和确定与CIRI预后相关的分子指标至关重要。
在本研究中，我们使用分子生物学技术研究了中脑动脉阻塞（MCAO）和再灌注损伤大鼠脑组织中miRNA表达的变化。我们还预测了可能受miRNA水平改变影响的下游目标mRNA和因素，旨在探索脑缺血-再灌注损伤的潜在机制。我们的研究可以为临床治疗提供新的见解和方法。
动物和伦理声明
成年大鼠购自广东海洋大学实验动物中心。使用8周大的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重为260±20克，用于MCAO模型实验。大鼠被饲养在通风良好的笼子里，温度为21-24°C，相对湿度约为50%，光照/黑暗周期为12小时，有充足的水和食物供应。实验大鼠被分为两组：手术组和假手术组。
大鼠中脑动脉阻塞（MCAO）模型的建立和鉴定
为了系统研究脑缺氧-缺血病理学中的基因和信号通路，我们使用大鼠MCAO模型来模拟脑缺血-再灌注损伤。通过管腔内缝合闭塞方法诱导大鼠的中脑动脉发生2小时的中风和24小时的再灌注。在行为评估方面，使用Longa评分[29]和EBST评分[30]来评估大鼠的神经损伤（图1）
讨论
关于缺血性中风的诊断和治疗，早期干预措施可以减轻患者神经组织的损伤，并减少后续后遗症对其日常生活的影响[38]。中脑动脉阻塞（MCAO）模型被广泛认为是研究缺血性中风的动物模型。在本研究中，我们建立的MCAO模型表现出明显的神经行为缺陷（Longa评分>1）。在TTC染色中，MCAO组大鼠
结论
本研究证实，大鼠在中风后皮层miRNA表达发生了动态变化。首次描述了参与氧化应激、炎症、细胞凋亡和再生过程的miRNA-mRNA及其下游调控网络通路，为它们在中风发展中的潜在作用提供了广阔的视角。研究中风后miRNA的变化和功能有助于我们更好地理解其分子机制
作者贡献声明
甘尚全：写作 – 审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取。胡光泽：正式分析。高瑞：写作 – 审稿与编辑、监督、资金获取。杨玉英：写作 – 原始草稿、数据管理。袁珊：实验研究。江武：写作 – 审稿与编辑、原始草稿
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
数据可用性
数据可应要求提供。
资助
本研究得到了国家自然科学基金（32472889）、广东省普通高校创新团队项目（2024KCXTD040）和广东海洋大学的科研启动资金（060302052308）的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有竞争性利益。
致谢
不适用。
