《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Establishing a Chimeric tRNA-sgRNA Scaffold and Computational Basis for Enhanced CRISPR Interference
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CRISPR/Cas9系统基因编辑效率受sgRNA稳定性与表达水平影响显著，本研究构建了整合Sephadex aptamer-HBV ε tRNA支架的sgRNA（SeptgRNA），通过结构模拟验证其增强sgRNA稳定性及dCas9三元复合物作用机制，在ampC和ompA基因敲低实验中展现出更优的基因抑制效果。
作者：金洁琳|杨晨轩|邓琴琴|吴龙江|陈旺|陈卓颖
陕西科技大学生物科学与工程学院，中国陕西汉中723000
摘要
CRISPR/Cas9系统彻底改变了基因组工程领域，然而优化单导向RNA（sgRNA）的稳定性和表达水平对于实现更有效的基因调控至关重要。转运RNA（tRNA）因其固有的稳定性而成为一种有价值的解决方案。在这项研究中，我们通过将sgRNA整合到Sephadex适配体-人HBV ε tRNA（SeptRNA）支架的反密码子茎部中，开发了一种嵌合tRNA-sgRNA（tgRNA），从而形成了SeptgRNA。当用于靶向大肠杆菌的ampC和ompA基因时，SeptgRNA的积累量显著高于传统的sgRNA。为了克服tRNA支架可能带来的空间阻碍，我们通过将SeptgRNA与失活的Cas9（dCas9）共表达来利用CRISPR干扰（CRISPRi），这有效地抑制了DNA转录。这种方法比传统的基于sgRNA的CRISPRi显示出更强的基因表达抑制效果。分子对接和分子动力学模拟表明，SeptRNA支架稳定了sgRNA的茎环结构，并增强了dCas9-tgRNA-DNA三元复合物的稳定性。我们的发现为使用嵌合tgRNA进行基因敲低提供了概念验证，突显了它们在提高表达水平和增强稳定性方面的潜力。这项研究进一步丰富了CRISPR/Cas9工具箱，并强调了tRNA支架在基因工程应用中的多功能性。
引言
成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9（CRISPR/Cas9）系统彻底改变了基因组工程领域，是近几十年来生命科学领域最具变革性的进展之一。该系统包括Cas9核酸酶、转激活crRNA（tracrRNA）和crRNA。Doudna及其同事的一项开创性工作是将双tracrRNA：crRNA工程化为单导向RNA（sgRNA）[1]，从而指导Cas9通过其HNH和RuvC样核酸酶结构域识别并切割目标双链DNA [2]。CRISPR/Cas9介导的基因组编辑效率在很大程度上取决于sgRNA的拷贝数和长度 [3]、[4]、[5]。研究表明，提高sgRNA的稳定性和表达水平不仅可以减少脱靶效应，还可以增加目标DNA的切割效率 [6]、[7]。这突显了开发提高sgRNA稳定性和可用性策略的重要性，从而提升CRISPR/Cas9系统在基因组工程中的效率。
转运RNA（tRNA）由于其紧凑的三维结构而具有固有的稳定性 [8]，能够抵抗降解并促进融合RNA序列在体内的积累 [9]、[10]。tRNA与sgRNA的融合最早在2015年得到报道 [11]。该系统依赖于侧翼tRNA的处理来释放sgRNA，在多种模型中表现出高效率，包括在木霉（Trichoderma reesei）[12]和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）[13]中的多重基因编辑。
然而，这些系统依赖于tRNA的侧翼序列来释放sgRNA，忽略了tRNA支架在RNA稳定性方面的结构优势。本研究提出了一种新概念，即利用Sephadex适配体-人HBV ε tRNA（SeptRNA）支架本身来构建嵌合SeptRNA-sgRNA（SeptgRNAs）（图1）。这种策略充分利用了SeptRNA支架的优势，超越了传统的串联融合方式。通过模仿天然tRNA结构，SeptRNAs能够被细胞机制有效处理，从而提高稳定性和表达水平 [14]。此外，SeptRNA支架可以整合长达300个核苷酸的结构化RNA插入片段而不破坏其折叠完整性，使得sgRNA序列能够稳定嵌入 [15]。通过将特定的sgRNA序列整合到反密码子茎部，我们保持了SeptRNA支架的结构完整性，并提高了sgRNA的产量和稳定性。我们使用了针对大肠杆菌ampC和ompA基因的sgRNA，这两个基因位点已被广泛研究，分别用于评估CRISPRi的效率，并且之前已经研究了它们在氨苄青霉素抗性和噬菌体相互作用中的作用 [16]。ampC基因编码AmpC β-内酰胺酶，这种酶通过水解β-内酰胺类抗生素来赋予抗生素抗性，其表达受AmpR和细胞壁回收中间产物的调控 [17]、[18]。ompA基因编码OmpA，这是一种多功能的外膜蛋白，对维持膜完整性、细胞粘附、免疫逃避、营养吸收和接合质粒转移至关重要 [19]、[20]。鉴于SeptRNA支架在sgRNA引导的Cas9活性过程中可能带来的空间阻碍，我们将研究重点从基因敲入和敲除转向了CRISPR干扰（CRISPRi）。这是通过将SeptgRNA嵌合体与失活的Cas9（dCas9）共表达来实现的。分子对接分析进一步阐明了SeptRNA在稳定sgRNA构象和沉默目标基因方面的作用，证明了其在有效基因组调控中的能力。
在这项研究中，我们专注于开发一种嵌合SeptgRNA，以提高sgRNA的稳定性和表达水平。通过使用这两个针对ampC和ompA基因的sgRNA作为模型，我们为嵌合SeptgRNA在基因敲低中的应用提供了概念验证。该策略旨在评估SeptgRNA在CRISPRi介导的基因抑制中的有效性，并通过分子对接和分子动力学（MD）模拟获得结构上的见解。这项工作显著增强了CRISPR/Cas9工具箱的功能，丰富了其在基因调控中的应用范围。
部分摘要
质粒构建
我们使用双质粒CRISPR/Cas系统来生产dCas9和各种RNA引导序列 [21]。pCas载体（Addgene # 62225）通过定点突变试剂盒（TOYOBO有限公司，大阪，日本）进行了改造，将Asp10和His840替换为丙氨酸，生成了pdCas变体（图3A），该载体在其天然启动子控制下表达dCas9。对于sgRNA的表达，我们使用了相应的引导序列N20
通过SeptRNA支架增强sgRNA的表达
我们首先将编码SeptRNA的DNA引入pTargetT载体，并使用大肠杆菌宿主进行表达（图S1A）。对于较大的嵌合SeptgRNA，我们优化并使用了5%的变性尿素-PAGE电泳。在这种凝胶浓度下无法分辨SeptRNA，但在转化了pTarget-tg-ampC和pTarget-tg-ompA的细胞中观察到了约260个核苷酸大小的明显条带（图S2A），表明嵌合SeptgRNA得到了成功表达。尽管在尿素-PAGE上的条带较淡，但Northern印迹分析显示...
讨论
CRISPR/Cas9系统已被广泛用于基因组操作，包括基因破坏 [37]、转录调控 [38] 和表观遗传修饰 [39]；然而，它面临着显著的脱靶效应 [40]、[41]、[42]。已经开发了几种策略来减轻这些效应，主要是通过修改Cas9蛋白本身来实现。这些策略包括使用核酸酶或Cas9的变体 [43]、将DNA结合结构域与Cas9融合 [44]、[45] 等。
结论
在这项研究中，我们设计了一种嵌合SeptgRNA，以提高CRISPR干扰系统中sgRNA的稳定性和表达水平。SeptRNA支架显著增强了sgRNA的积累，并增强了ampC和ompA基因的抑制效果，分子对接和分子动力学模拟进一步表明了sgRNA结构以及dCas9-tgRNA-DNA复合物的稳定性。这项工作确立了SeptgRNA作为一种有效的RNA支架策略，为未来的研究奠定了基础
作者贡献声明
陈卓颖：撰写 – 审稿与编辑。吴龙江：撰写 – 审稿与编辑、监督、概念构思。邓琴琴：撰写 – 审稿与编辑。杨晨轩：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、实验研究。金洁琳：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、实验研究、数据分析。陈旺：撰写 – 审稿与编辑数据可用性
数据包含在手稿中。
资金来源
本研究未获得公共部门、商业机构或非营利组织的任何特定资助。
利益冲突声明
作者们没有需要声明的利益冲突。
