《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research》：Mutant-specific dysfunction of
RHOBTB2 impairs mitochondrial function and Na+/K+-ATPase levels in a cell model
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RHOBTB2突变通过调控离子通道和线粒体功能影响神经发育疾病机制，热点突变体在核/线粒体积累并导致NKA降解和线粒体呼吸障碍，提示其与癫痫易感性的关联。
宫本幸子|山下俊一|哈兹拉特·贝拉尔|加藤光宏|坎基智武|斋藤宏人
日本静冈县滨松市汉代山1-20-1，滨松大学医学院生物化学系，431-3192
摘要
RHOBTB2是一种非典型的Rho GTP酶，与发育性和癫痫性脑病有关，但其致病机制仍不完全清楚。在这项研究中，我们建立了一个细胞模型，通过多西环素诱导系统来表达RHOBTB2，以探讨与该疾病相关的RHOBTB2突变体的功能后果。蛋白质表达和定位分析显示了突变体特有的行为：GTP酶结构域突变体（如D92H和W217C）与野生型（WT）相比，RHOBTB2蛋白水平没有显著差异，而热点突变体（R461H、R485C、R489Q）则表现出RHOBTB2蛋白水平升高，并在细胞核和线粒体中积累。RNA-seq分析表明，表达每种突变体的细胞显示出不同的转录组变化。值得注意的是，R489Q突变体的诱导导致离子通道相关基因的显著下调，这支持了其在破坏神经元兴奋性方面的潜在作用。此外，突变型RHOBTB2的表达通过溶酶体依赖的降解途径降低了Na+/K+-ATP酶（NKA）蛋白的水平。这种效应在GTP酶结构域突变体（D92H和W217C）中尤为明显，表明突变型RHOBTB2与离子稳态障碍之间存在机制联系。另外，R489Q和W217C突变体损害了线粒体呼吸功能，而其他突变体则没有表现出可检测的线粒体功能障碍。重要的是，Y284D癌相关突变体没有表现出这些表型，这突显了不同突变位点在功能上的多样性。一些突变体中观察到的离子转运途径失调和线粒体损伤可能是导致RHOBTB2相关脑病中癫痫发作易感性的关键机制。
引言
新的RHOBTB2错义变异与发育性和癫痫性脑病（DEE64，MIM 618004）有关[[1]，[2]，[3]，[4]]。RHOBTB蛋白与其典型的Rho GTP酶不同，具有非典型的结构域。RHOBTB蛋白结构由N端的GTP酶结构域、一个富含脯氨酸的区域、两个BTB结构域以及C端结构域组成，后者对蛋白的稳定性和功能至关重要[5,6]。靠近BTB结构域的变异体与严重的发育迟缓和癫痫性脑病相关，而靠近GTP酶结构域的变异体则与多种神经发育症状相关[4]。此外，双等位基因截短变异也被证明会导致神经发育症状和癫痫发作[4]。值得注意的是，一些携带RHOBTB2变异的患者表现出运动障碍和偏瘫等症状，这些症状类似于由ATP1A3突变引起的儿童交替性偏瘫（AHC），后者编码Na+/K+-ATP酶（NKA）的α3亚型[3]。
人类有三种RHOBTB蛋白（1–3），其中RHOBTB2作为肿瘤抑制基因受到特别关注，因为它是在乳腺癌中首次发现的[7,8]。RHOBTB2作为Cullin3（CUL3）依赖的泛素连接酶，靶向特定蛋白质进行蛋白酶体降解[5,6,9]。然而，RHOBTB2本身也会被泛素-蛋白酶体系统泛素化并降解[8,9]，导致RHOBTB2蛋白水平降低。先前的研究表明，靠近BTB结构域的氨基酸替换突变体会导致RHOBTB2的积累，而靠近GTP酶结构域的突变体则没有明显的蛋白积累[3,4]。热点突变体还通过降低蛋白质的折叠自由能来增加其构象稳定性，从而促进RHOBTB2的积累[10]。最近在果蝇模型中的RNA-seq分析显示SCN1A表达减少，同时钠通道与RHOBTB2之间存在强烈相互作用[11]。
在这项研究中，我们建立了可以通过多西环素诱导RHOBTB2表达的细胞系，以探索RHOBTB2突变体的具体效应。我们发现，热点RHOBTB2突变体的诱导导致其在细胞核和线粒体中的显著积累。RNA-seq分析显示，表达R489Q突变体的细胞中通道相关基因的表达减少。此外，突变型RHOBTB2的表达通过溶酶体依赖的降解途径降低了NKA蛋白的水平。R489Q和W217C突变体还损害了线粒体呼吸功能，而其他突变体则没有表现出可检测的线粒体功能障碍。这些发现为RHOBTB2相关疾病的分子多样性提供了新的见解，并强调了可诱导表达系统在解析突变体特异性机制方面的实用性。
质粒构建
本研究中使用的RefSeq访问号为NM_015178.3，对应于MANE Select转录本。该转录本与之前报道中使用的NM_001160036.2之间的关系在表S1中进行了总结。全长野生型（WT）人类RHOBTB2 cDNA（编码727个氨基酸）被克隆到pEF1a-1xFlag-C1-hygro载体中，生成氨基端带有Flag标签的RHOBTB2。定点突变使用KOD-Plus-Mutagenesis试剂盒（Toyobo）进行。
RHOBTB2突变体的功能表征揭示了其不同的亚细胞定位
我们分析了七种突变体：WT、D92H（GTP酶结构域突变体）、W217C（靠近GTP酶结构域的突变体）、R461H、R485C、R489Q（靠近BTB结构域的热点突变体）和Y284D（之前在肺癌中发现的突变体）（图1A，图S1，表S1）。为了研究细胞模型中的突变体特异性效应，我们使用了Flp
In? T-REx? 293细胞系，以实现Flag标记的人类RHOBTB2构建体的受控和单拷贝整合表达。我们首先评估了时间依赖性
讨论
自2018年首次报道携带RHOBTB2变异的患者以来，已发现的病例数量逐渐增加。然而，RHOBTB2相关神经发育障碍的分子和细胞机制仍不完全清楚。在这项研究中，我们成功建立了通过多西环素诱导RHOBTB2表达的稳定细胞系，为研究疾病相关的功能改变提供了一个有价值的平台。
先前的研究主要集中在
局限性
这项研究为
RHOBTB2变异的致病性提供了重要的机制见解。然而，也应承认几个局限性。首先，所有功能分析都是在HEK293衍生的Flp
In? T-REx? 293细胞中进行的，这些细胞是非神经细胞，可能无法完全再现
RHOBTB2内源性表达的神经元环境。因此，某些观察结果，特别是与亚细胞定位、离子通道表达和NKA调节相关的结果，可能无法完全反映实际情况
CRediT作者贡献声明
宫本幸子：撰写——初稿，研究，数据整理。山下俊一：研究。哈兹拉特·贝拉尔：概念构思。加藤光宏：撰写——审稿与编辑，概念构思。坎基智武：撰写——审稿与编辑，项目管理。斋藤宏人：撰写——审稿与编辑，项目管理，概念构思。
写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备这项工作时，作者使用了ChatGPT进行英语校对。使用该工具/服务后，作者根据需要对内容进行了审查和编辑，并对发表文章的内容承担全部责任。
资助
本研究得到了日本医学研究开发机构（AMED）（JP25ek0109647，H.S.）、日本学术振兴会（KAKENHI，项目编号JP23K27566，H.S.）和早期职业科学家资助计划（24K188790，S.M.）的支持。
致谢
我们感谢滨松大学医学院高级研究设施与服务（ARFS）的C. Ogawa及其团队提供的技术支持。
