《PLOS Genetics》：Huntington’s disease-associated ankyrin repeat palmitoyl transferases are rate-limiting factors in lysosome formation and fusion
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本综述深入探讨了亨廷顿病（HD）相关棕榈酰转移酶HIP14/HIP14L（及其果蝇同源物Hip14/Patsas）作为溶酶体形成与融合关键限速因子的新功能。研究通过果蝇模型揭示，这些高尔基体驻留酶通过调控分泌颗粒-溶酶体融合、溶酶体酸化及水解酶运输，维持细胞内膜运输稳态，其功能障碍直接导致HD样溶酶体功能紊乱及神经退行性表型，为HD发病机制提供了全新视角。
Abstract
蛋白棕榈酰化在高尔基体中对分泌系统和溶酶体系统的多种蛋白的正确分选至关重要，缺陷性棕榈酰化可导致严重病理的发生。HIP14和HIP14L这两种含有锚蛋白重复序列的棕榈酰转移酶与亨廷顿病（HD）的发病机制相关，然而这些高尔基体驻留酶的扰动如何导致神经系统疾病尚待阐明。本研究调查了Hip14和Patsas（分别是HIP14和HIP14L的果蝇直系同源物）的功能，以揭示它们在分泌和溶酶体膜运输中的作用。利用幼虫唾液腺（一个成熟的调节性分泌途径模型），我们发现这些PAT酶通过介导分泌颗粒与内溶酶体区室的融合，同等程度地促进了胶水分泌颗粒的适当成熟和 crinophagic 降解。我们还揭示了Patsas和Hip14都是溶酶体酸化和多种溶酶体水解酶的生物合成运输所必需的，并且我们证明了分泌颗粒-溶酶体融合的速率及随后的酸化与Hip14的水平呈正相关。此外，Hip14对于成年大脑中正常的溶酶体形态和神经元功能也至关重要。最后，我们发现通过表达组成型活性形式的Rab2来过度激活溶酶体生物合成运输和溶酶体融合，可以补偿在幼虫唾液腺和神经元中由Patsas或Hip14缺失引起的溶酶体功能障碍。因此，我们提出锚蛋白重复棕榈酰转移酶作为溶酶体融合的限速因子发挥作用，并提供了遗传学证据表明缺陷性蛋白棕榈酰化及随后的溶酶体功能障碍可导致亨廷顿病样症状的出现。
Author summary
越来越多的证据表明，由突变亨廷顿蛋白积累引起的HIP14和HIP14L棕榈酰转移酶活性降低以及随后的蛋白棕榈酰化改变在亨廷顿病（HD）的发病中起着关键作用。然而，由于棕榈酰化受损，哪些细胞过程受到干扰并最终导致HD的出现仍知之甚少。在我们的研究中，我们使用果蝇模型来揭示Hip14和Patsas（HIP14L的果蝇直系同源物）在分泌和溶酶体膜运输中的作用。我们发现，在幼虫唾液腺中沉默这些转移酶会同等程度地破坏分泌颗粒-溶酶体融合、随后的酸化以及溶酶体水解酶的适当运输。而Hip14的过表达则加速了这些过程。我们还观察到，神经元特异性缺失Hip14不仅扰乱了溶酶体形成，还导致神经肌肉功能的进行性下降。重要的是，在Hip14和Patsas缺陷背景下出现的溶酶体和神经元缺陷都可以通过Rab2 GTP酶介导的溶酶体形成和融合的过度激活来恢复。这些发现表明，Hip14和Patsas通过作为溶酶体形成和融合的限速因子来防止HD样症状的出现。
Introduction
棕榈酰化是一种可逆的翻译后脂质修饰，它改变底物蛋白的疏水性，从而影响其细胞内运输、膜结合、稳定性以及与其他蛋白质的相互作用。细胞内信号传导和运输的调节因子在这些底物蛋白中过度表达，因此改变的棕榈酰化与多种疾病的发生有关，例如癌症、糖尿病和神经系统疾病。将棕榈酸链转移到底物蛋白的半胱氨酸残基上是由DHHC（Asp-His-His-Cys）棕榈酰酰基转移酶（PAT）催化的，该酶由4-6个跨膜结构域和一个包含同名DHHC催化基序的胞质富含半胱氨酸结构域（CRD）组成。此外，哺乳动物的DHHC17/HIP14和DHHC13/HIP14L拥有一个额外的N端锚蛋白重复结构域（ANK），该结构域与几种参与神经元功能的底物相互作用并调节其亚细胞定位，包括亨廷顿病相关蛋白亨廷顿蛋白（HTT）。在亨廷顿病（HD）中，HTT基因中的CAG核苷酸扩展导致HTT蛋白中出现多聚Q扩展，这降低了其与HIP14和HIP14L的相互作用，因此，它们的酶活性降低，推测导致多种突触蛋白的错位。与此一致，缺乏HIP14或HIP14L的小鼠会出现类似于HD的神经病理表型。突触蛋白的递送与分泌途径相关。具有不同细胞目的地（质膜、溶酶体、分泌颗粒）的分泌蛋白的分选发生在高尔基体反式网络，并且棕榈酰化已被认为是蛋白质前向、质膜定向运输的关键调节因子。由于HIP14和HIP14L都是高尔基体驻留酶，因缺陷性棕榈酰化导致的突触蛋白错位表明这些PAT可能在维持高尔基体中适当的蛋白质分选中起关键作用。然而，这些PAT如何调节高尔基体后的膜运输途径在很大程度上尚未探索。
果蝇是模拟人类疾病（如HD或其他神经退行性疾病）和理解遗传学及细胞生物学基础改变的优秀且流行的体内实验系统。此外，晚期L3期果蝇幼虫的唾液腺也成为研究高尔基体后运输的遗传调控，特别是分泌和溶酶体途径复杂关系的强大平台。幼虫唾液腺细胞合成并分泌大量粘液性Sgs（唾液腺分泌）或胶水蛋白以响应蜕皮激素ecdysone。胶水蛋白在高尔基体反式网络被包装到未成熟的分泌颗粒中，这些颗粒经历复杂的成熟过程，包括通过同型融合显著增大体积、进行性酸化、分泌物质的深刻重塑以及获得胞吐作用所需的膜蛋白。这是通过成熟中的分泌颗粒和溶酶体之间的一系列融合事件来确保的，这些事件控制着整个分泌途径中分泌物质的数量和质量。因此，分泌颗粒与异质的非降解性溶酶体群体的融合对其成熟至关重要，而过量或异常的分泌颗粒则与降解性溶酶体融合，通过crinophagy进行选择性降解。
果蝇基因组编码两种含有ANK结构域的PAT：Hip14 (CG6017) 和 Patsas (CG6618)，它们在神经组织中含量丰富并定位于高尔基体。与哺乳动物的结果一致，Hip14通过直接棕榈酰化调节半胱氨酸串蛋白（CSP）和突触小体相关蛋白25（Snap-25）的递送，对于适当的发育和有效的突触发生和突触传递至关重要。相比之下，Patsas的特征仍然很差。这提出了Hip14（以及潜在的Patsas）在突触运输中具有保守功能的可能性，但这些高尔基体定位的ANK PAT如何在细胞和分子水平上控制高尔基体后的分泌途径仍然难以捉摸。在这里，我们使用果蝇幼虫唾液腺来理解Hip14和Patsas在调节性分泌途径中的作用，并揭示它们在分泌颗粒-溶酶体融合中的作用，并强调它们对神经元功能的潜在影响。
Results
1. Patsas和Hip14对于分泌颗粒内容的适当 crinophagic 降解及其与PI3P阳性内体的融合至关重要
我们选择果蝇幼虫的唾液腺作为模型系统来研究ANK PATs在高尔基体后运输中的作用。由于分泌颗粒的成熟或 crinophagic 降解需要分泌系统和溶酶体系统的微调相互作用，这些可以作为高尔基体后运输完整性的良好指标。由于Hip14和Hip14L在哺乳动物细胞中被鉴定为高尔基体驻留酶，我们还在幼虫唾液腺中通过将Tomato标记的Hip14与Golgin-245共染色验证了Hip14的高尔基体定位。由于Hip14和Patsas在高尔基体定位已在S2细胞中得到证实，并且Hip14在成年果蝇大脑中的定位也已被其他人证实，我们得出结论，与其人类直系同源物类似，果蝇Hip14和Patsas主要在高尔基体发挥作用。我们检测了Patsas和Hip14 PAT酶在 crinophagic 降解中的潜在作用。在蛹形成的第一小时（产卵后约120小时，此后称为白前蛹期/wpp），大多数胶水颗粒已被分泌，细胞内捕获的未分泌颗粒与降解性溶酶体融合形成 crinosomes。为了评估 crinophagic 降解的效率，我们通过在分泌腺细胞中表达N端GFP和dsRed标记的Sgs3胶水蛋白进行了 crinophagic 流测定。两种报告蛋白被同等分选到形成的胶水颗粒中，因此这些颗粒显示为GFP和dsRed双阳性结构。与酸性溶酶体融合后，分泌颗粒转化为降解性 crinosomes，其中高酸性环境导致GFP（而非dsRed）信号淬灭，因此报告蛋白之间的重叠与 crinophagic 降解速率呈负相关，成熟的 crinosomes 显示为dsRed阳性但GFP阴性的结构。我们使用RNAi介导的Patsas和Hip14敲低来研究它们对 crinophagic 流的假定影响。与大多数只含有dsRed的 crinosomes 的对照细胞相比（58.7%的dsRed颗粒为GFP阴性），Patsas和Hip14沉默的细胞积累了双阳性的完整胶水颗粒，只有11.2%（Patsas RNAi）和5.5%（Hip14 RNAi）的dsRed颗粒为GFP阴性。为了确认这种表型不是由于RNAi转基因的脱靶效应，我们用靶向Hip14和Patsas的独立RNAi系重复了相同的实验，它们导致了相同的 crinophagic 流扰动。由于Patsas和Hip14 RNAi都引起了类似的 crinophagy 缺陷，我们还测试了这些PAT是调节同一途径的不同步骤还是彼此冗余地起作用，并进行了上位性分析。首先，我们在同一唾液腺中同时敲低两种PAT，这引起了与单个RNAi相似的 crinophagy 扰动。此外，Hip14的过表达可以挽救Patsas RNAi和Hip14 RNAi的缺陷流表型。这些结果表明，这两种酶更可能是调节同一途径的不同步骤，并且Hip14可能作用于Patsas的下游。
除了对 crinophagic 流的影响外，我们还观察到沉默Patsas或Hip14也导致Sgs3-dsRed阳性结构的大小显著减小，而它们的数量没有显著变化。由于这些结构在对照唾液腺中在这个发育阶段（白前蛹期）主要代表 crinosomes，这一发现进一步表明Patsas和Hip14缺陷细胞存在 crinosome 形成缺陷，其中较小的dsRed阳性结构很可能代表无法成熟为 crinosomes 的分泌颗粒（SGs）。
在白前蛹期，胶水颗粒通过与内体融合获得磷脂酰肌醇3-磷酸（PI3P）阳性膜，支持 crinosomes 的形成。连同Sgs3-dsRed SG标记，我们表达了GFP-myc-2xFYVE PI3P特异性探针来研究这些内体融合。在对照细胞中，FYVE阳性环出现在Sgs3-dsRed阳性的 crinosomes 周围，表明与PI3P阳性内体成功融合。然而，在缺乏Patsas和Hip14 PAT酶的情况下，这些内体融合受到同等程度的干扰，PI3P+内体在胶水颗粒间积累，FYVE-GFP围绕颗粒的环状模式大多消失。因此，Patsas和Hip14同样为残留胶水颗粒与PI3P阳性内体的融合以及 consequently crinosomes 的形成所必需。
2. Patsas和Hip14是成熟分泌颗粒与溶酶体融合及其随后酸化所必需的
由于Patsas和Hip14被证明是未分泌SGs成熟为 crinosomes 及其随后的 crinophagic 降解（在白前蛹期）所必需的，我们旨在测试它们对胶水颗粒成熟（在其大量释放之前）的潜在影响。分泌颗粒与含有非降解性溶酶体的异质溶酶体区室的融合伴随着分泌颗粒的复杂成熟过程，在蛹形成前2小时（2h bpf）建立其适当的膜组成和内容物以用于胞吐释放。我们分析了在表达N端GFP标记的Arl8小GTPase（一个成熟的溶酶体标记物）和Sgs3-dsRed报告蛋白的唾液腺细胞中，成熟胶水颗粒与溶酶体之间的融合。在对照细胞中，GFP-Arl8阳性环出现在Sgs3-dsRed结构周围，表明成功的SG-溶酶体融合。相反，在缺乏Patsas或Hip14的情况下，Arl8阳性溶酶体在胶水颗粒间积累，而不是在它们周围形成环。重要的是，这种融合缺陷在Patsas、Hip14双敲低的唾液腺中没有进一步加剧，表明这些酶在此过程中不冗余，并且两者都是成熟分泌颗粒与溶酶体有效融合所必需的。除了有缺陷的溶酶体融合外，在2h bpf时，Patsas和Hip14单敲和双敲低细胞中也检测到成熟SGs尺寸减小，而SGs数量在这些基因型中没有显示任何显著变化。
分泌颗粒的逐渐酸化伴随着其成熟，促进其分泌内容的重塑和加工，以达到胞吐前适当的稠度，并且这种酸化高度依赖于分泌颗粒-溶酶体融合。为了评估成熟胶水颗粒的酸化是否受ANK PATs影响，我们用LysoTracker deep Red（LTdR）活性染料染色表达Sgs3-dsRed的唾液腺细胞，该染料选择性标记酸性结构如溶酶体和 crinosomes。在对照唾液腺中，在2h bpf年龄出现大的LTdR阳性结构，这些也对Sgs3-dsRed呈阳性，表明在此阶段有效的SG-溶酶体融合。相反，在Patsas和Hip14缺陷细胞中，LTdR阳性结构的平均大小（而非数量）显著下降，并出现小的点状溶酶体，表明这些ANK PATs的缺失 critically 降低了SG-溶酶体融合的效率。为了评估高尔基体棕榈酰化的过度激活是否可能导致相反的效果，我们在同龄唾液腺中过表达了Hip14，并观察到LTdR信号强度显著增加，然而，这些结构的大小和数量与对照相比没有改变。因此，我们得出结论，Patsas和Hip14是成熟分泌颗粒适当酸化所必需的，并且酸化程度与Hip14的水平呈正相关。有趣的是，在Hip14过表达细胞中，SGs的平均大小显著下降，但其数量保持不变，表明Hip14主要支持SG-溶酶体异型融合，并不通过促进SG-SG同型融合来促进SG生长。
酸化、氯离子和钙离子的摄取驱动成熟胶水颗粒和 crinosomes 内容的结构重塑，这可以在超微结构水平上进行监测。在对照细胞中，在2h bpf阶段可以观察到具有多个电子致密核心的大成熟颗粒。尽管在缺乏Patsas或Hip14的情况下，胶水颗粒显示出相似的形态，但融合不兼容或停靠的溶酶体经常出现在其附近。相反，过表达Hip14的唾液腺细胞显示出小的未成熟分泌颗粒，并过早出现具有异常多泡或多层形态的 crinosomes，其中含有高度分解形式的胶水样物质。重要的是，这些过早的 crinosomes 很可能代表了用LTdR非常强烈标记的酸性结构。这些结果进一步支持了Patsas或Hip14 PAT酶是成熟分泌颗粒与溶酶体异型融合所必需的，并作为其限速因子。
3. ANK PAT介导的异型融合负向调节Sgs3分泌
由于ANK-PATs的过表达和沉默都导致SG尺寸减小，我们通过测试Patsas和Hip14对胶水分泌的影响进一步分析了SGs的命运。我们应用了一个简单但成熟的实验设置：在对照白前蛹中，分泌的胶水可以在蛹附着于小瓶壁的表面上检测为Sgs3-dsRed阳性痕迹，而未分泌的胶水在唾液腺中显示为残留的dsRed信号。有趣的是，尽管在Patsas和Hip14 RNAi白前蛹中也检测到分泌胶水的信号，但唾液腺中的dsRed信号较弱。相反，Hip14过表达导致胶水分泌减少，并伴有Sgs3-dsRed在唾液腺中的大量滞留。这些发现表明SG释放受ANK-PATs负向调节，并且在ANK-PAT缺陷和Hip14过表达细胞中可检测到的较小SG尺寸可能分别归因于分泌增加或SGs的 crinophagic 消除加速。
4. Patsas和Hip14参与溶酶体水解酶的生物合成运输
由于两种ANK PATs的存在对于溶酶体与分泌颗粒的适当融合至关重要，我们有兴趣了解这些高尔基体驻留酶是否也是溶酶体生物合成运输和功能所必需的。为了评估这些PAT是否是溶酶体酸化的通用调节因子，我们在表达Lamp1-GFP晚期内体/溶酶体报告蛋白的唾液腺上进行了额外的LysoTracker Red（LTR）染色，其中GFP部分位于溶酶体膜的内腔侧并暴露于酸性环境。在此，在对照细胞中，出现胶水颗粒大小的大的LysoTracker阳性结构，其中Lamp1-GFP信号大多被淬灭，两种标记物几乎不共定位。然而，在缺乏Patsas或Hip14的情况下，LTR阳性结构尺寸更小，并且经常与Lamp1-GFP重叠，代表融合缺陷和酸性较弱的溶酶体，而LTR结构的数量在这些中发生了改变。相反，Hip14的过表达引起大的LysoTracker阳性结构的大量积累，这些结构用染料标记的强度高于对照细胞，并且缺乏Lamp1-GFP。
为了评估Patsas和Hip14酶在溶酶体蛋白分选和运输中的假定作用，我们对表达Lamp1-GFP报告蛋白的细胞进行了溶酶体蛋白酶组织蛋白酶L的免疫染色。在对照细胞中，组织蛋白酶L与Lamp1-GFP显示出中度共定位，尤其是在较小的囊泡上。相反，缺乏Patsas或Hip14同等程度地导致组织蛋白酶L阳性结构的尺寸减小，变得更多呈点状，并导致两种标记物之间更广泛的共定位。重要的是，这种尺寸减小并不伴随组织蛋白酶L阳性结构丰度的增加，表明ANK PAT缺陷组织中溶酶体区室的形成和完整性受损。最后，Hip14的过表达增加了组织蛋白酶L结构的尺寸，而非数量。由于这些增大的组织蛋白酶L阳性结构不与Lamp1-GFP共定位，表明它们很可能代表了非常酸性的、多泡的 crinosomes，其中Lamp1-GFP报告蛋白被迅速降解。
为了在超微结构水平跟踪溶酶体酶的运输，我们进行了G?m?ri酸性磷酸酶（AcPase）酶细胞化学，这使我们能够跟踪溶酶体AcPase酶活性的亚细胞定位。胶水颗粒在成熟过程中逐渐获得AcPase酶，可能通过与非降解性溶酶体融合。我们在不同发育阶段的幼虫唾液腺上进行了此测定。我们观察到，在早期L3幼虫阶段（6h bpf）的对照细胞中，未成熟的胶水颗粒含有少量酸性磷酸酶阳性沉淀物。稍后，在大量胶水分泌前不久（2h bpf），成熟的胶水颗粒中存在更多的AcPase信号。在缺乏Patsas或Hip14 PAT酶的情况下，胶水颗粒和 crinosomes 在整个成熟过程中含有较少的AcPase沉淀物，同时在2h bpf阶段，AcPase含有的多层/多泡溶酶体在颗粒边缘或邻近处同时积累。相反，在过表达Hip14的细胞中，AcPase阳性的 crinosomes 在最早（6h bpf）阶段就出现，并具有不规则的多泡形态。有趣的是，过早形成的 crinosomes 分为两组：那些主要含有胶水的显示出更多的AcPase沉淀，而那些具有多泡形态的则含有较少但仍可检测到的AcPase沉淀物和减少的胶水含量，推测是由于其降解增强。在2h bpf阶段，主要可以检测到具有中等AcPase信号的未成熟胶水颗粒，而多泡 crinosomes 只有残留的AcPase含量。这些结果表明，溶酶体酶运输在缺乏Patsas或Hip14棕榈酰转移酶的情况下严重受损，这 consequently 也延迟了胶水颗粒的成熟。相反，Hip14的过表达能够增强溶酶体与胶水颗粒的融合，导致组织蛋白酶L和AcPase阳性的 crinosomes 过早出现。总之，我们的数据表明，尽管在缺乏Patsas或Hip14的情况下溶酶体水解酶仍可以到达溶酶体区室，但溶酶体酶的适当运输和亚细胞分布受到ANK PATs的关键影响。
最后，为了评估ANK PAT依赖性改变溶酶体运输是否也影响溶酶体水解酶的酶活性，我们用MagicRed对2h bpf年龄的唾液腺进行染色，MagicRed是一种内吞示踪剂，在活性降解的溶酶体腔内被组织蛋白酶L介导的切割后变得荧光。对照组织显示两组MagicRed阳性结构：首先是较小的点状部分，也对Lamp1-GFP呈阳性，可能代表未成熟溶酶体或晚期内体，而较大的、Lamp1-GFP阴性的
