果蝇产卵过程中TRP通道Painless介导的腿部基质刚度感知机制研究

《PLOS Genetics》：The TRP-channel painless mediates substrate stiffness sensing in the legs during Drosophila oviposition

本研究揭示了果蝇（Drosophila melanogaster）产卵时通过腿部TRPA通道Painless感知基质刚度的新颖机制。作者发现，位于跗节（tarsi）的钟形感器（campaniform sensilla）和腹侧机械感器刚毛（ventral mechanosensory bristles）通过painless基因介导的机械感觉神经元通路，调控雌蝇对较软产卵基质的选择偏好。该研究首次阐明campaniform sensilla作为间接刚度传感器的功能，为理解昆虫机械感觉（mechanosensation）与行为决策的神经遗传基础提供了重要证据。

　　

在卵生动物中，选择合适的环境产卵对其后代的生存至关重要。果蝇作为研究模型，其雌蝇在产卵前会全面评估基质的特性，以确保后代获得优质资源。这一复杂决策过程依赖于多种环境感觉线索的接收与整合。虽然嗅觉和味觉等化学感觉模态在影响产卵决策中的作用已被广泛研究，但介导机械特性（如基质刚度）感知的神经遗传结构却知之甚少。

Tarsi are required to sense stiffness of oviposition substrates

研究表明，果蝇腿部末端的跗节（tarsi）在评估潜在产卵基质的纹理特性中起着关键作用。通过两选择产卵实验（two-choice oviposition assay），比较雌蝇在软（0.25%琼脂糖）和硬（0.75%琼脂糖）基质上的产卵偏好，发现切除口器（proboscis）并不影响雌蝇对较软基质的选择偏好，而切除所有跗节则显著削弱了这种偏好。尽管附肢切除后的果蝇产卵总数减少，但仍足以进行偏好比较，这强有力地表明跗节是感知产卵基质纹理特性所必需的器官。

The TrpA channel painless functions in the selection of softer oviposition substrates

为了探究参与感知基质刚度的机械感觉基因，研究人员筛选了多个已知参与机械感觉信号接收、转导甚至伤害性通路（nociceptive pathways）的基因突变体。利用两选择群体实验，发现nompA、piezo、ppk和nan基因的突变体果蝇与对照组果蝇表现出相似的产卵偏好。然而，不同等位基因的painless（pain）基因突变体（pain^EP2251和pain^EP2451）则表现出对较软基质的产卵偏好显著降低。为了进一步确认表型，研究人员开发了一种高通量单蝇行为实验装置，可同时测试56只雌蝇的个体偏好。在野生型果蝇中，当硬侧基质琼脂糖浓度递增至1.25%时，对软侧（0.5%琼脂糖）的产卵偏好达到峰值并趋于稳定。因此，后续实验选择0.5%与1.25%琼脂糖作为软硬基质对比。在单蝇实验中，pain突变体同样表现出对较软基质的偏好缺陷，而另一个TRPA家族成员TrpA1的无效突变体则与对照组无异，这表明pain在感知产卵基质刚度方面具有特异性。

painless-expressing neurons of the leg mediate the choice of a softer egg-laying substrate

鉴于跗节切除和pain突变均导致选择较软基质的能力受损，研究人员推测pain可能在跗节中发挥作用。为了验证这一假设，他们利用温度敏感型shibire（UAS-shi^ts）条件性阻断所有pain表达神经元（pain-Gal4>UAS-shi^ts）的神经传递。在限制性温度（31°C）下，实验组果蝇选择较软基质的能力受损。为了特异性沉默腿部pain表达神经元，研究人员采用了交集遗传学方法（intersectional genetic approach），结合在腿部表达翻转酶（flippase）的dac[H1]-flippase品系和条件性UAS-FRT-stop-FRT Kir2.1效应器。通过脑和腹神经索（ventral nerve cord）成像验证，Kir2.1::eGFP的表达被限制在同时具有dac-flp和pain-Gal4活性的腿部神经元中。在单蝇两选择实验中，腿部pain阳性神经元被沉默的果蝇（pain-Gal4/+; dac[H1] Flp, UAS>stop>Kir2.1/+）表现出选择较软基质的能力显著降低，这与全局沉默pain神经元的结果一致，强化了pain在腿部介导产卵基质选择中起作用的假说。

painless-expressing neurons innervate campaniform sensilla, chemosensory bristles and mechanosensory bristles in the tarsi

跗节包含三种类型的外部感觉器官：钟形感器（campaniform sensilla, CS）、化学感器刚毛（chemosensory bristles）和机械感器刚毛（mechanosensory bristles）。通过成像pain-Gal4, UAS-GFP果蝇的离体跗节，发现pain表达的感觉神经元支配了所有这三种类型的外部感觉器官。钟形感器在跗节中呈单生或簇状分布，pain-Gal4标记的神经元支配了这些CS的子集，主要位于背侧，靠近跗节间的关节或最远端跗节的爪附近。此外，在支配化学感器刚毛的神经元中也观察到pain-Gal4>GFP表达，每个器官有3-4个细胞束，其树突延伸到刚毛的轴部，这是化学感觉神经元的典型特征。最后，GFP表达也出现在支配跗节腹侧机械感器刚毛的神经元中，主要位于前胸腿近端第1-2跗节以及中、后胸腿的第1-3跗节。

Dorsal campaniform sensilla and ventral mechanosensory bristles are required for discriminating oviposition substrates of varying stiffnesses

根据pain在跗节中的表达模式，研究人员进一步探究了每种外部感觉器官在刚度偏好中的独特贡献。他们利用在不同器官神经元中特异性表达的Gal4品系来操纵其活性。poxn-Gal4在化学感器刚毛的化学感觉神经元中表达；R38B08-Gal4在机械感器刚毛的机械感觉神经元中表达；为了靶向腿部钟形感器的不同且部分重叠的子集，研究人员使用了第一代驱动品系R34E04-GAL4（CS1）以及两个自行构建的split-GAL4品系SS69574-Gal4（CS2）和SS69602-Gal4（CS3）。为了破坏这些驱动剂标记的感觉器官的神经传递，研究人员使用了UAS-Kir2.1或（在出现发育致死性的情况下，如CS1和poxn-Gal4）UAS-shi^ts。

化学感觉神经元的沉默：在限制性温度（31°C）下，用poxn-Gal4表达UAS-shi^ts会导致对较软斑块的偏好显著降低，但在对照组（仅Gal4或仅UAS）中也观察到类似效应，表明这种偏好变化可能仅源于温度改变。为了特异性沉默腿部化学感觉神经元，研究人员再次使用了dac-flippase介导的交集策略。在单蝇实验中，腿部化学感觉神经元被沉默的果蝇表现出与对照组相当的产卵偏好。由于只有一部分腿部化学感觉神经元被沉默，且poxn-Gal4不在化学感器器官的机械感觉神经元中表达，因此不能排除化学感觉神经元在刚度感知中的作用。

机械感器刚毛神经元的沉默：利用R38B08-Gal4的完整表达谱表达UAS-Kir2.1，导致对较软基质的产卵偏好降低，但仅在与Gal4对照组相比时达到显著水平。由于R38B08-Gal4也非腿部特异性表达，研究人员使用了dac-flippase交集方法。在单蝇实验中，阻断这些腿部神经元的神经传递显著降低了对较软侧的产卵偏好，表明这些神经元参与选择行为。

钟形感器机械感觉神经元的沉默：首先使用广泛的驱动剂CS1-Gal4，其标记支配腿部众多CS以及一些机械感器刚毛的机械感觉神经元。在限制性温度下，用CS1-Gal4驱动UAS-shi^ts显示出偏好显著降低。由于CS1-Gal4也在中枢神经系统中表达，研究人员再次使用dac-flippase将Kir2.1介导的沉默限制在腿部特异性神经元。腿部限制性CS1-Gal4沉默果蝇在单蝇两选择实验中表现出对较软基质的偏好显著降低。为了分离钟形感器的特异性贡献，研究人员使用了严格限制于这些器官的两个split-Gal4驱动剂CS2和CS3。两者均显示外周投射，但在中枢神经系统中无胞体。用CS2-Gal4和CS3-Gal4驱动UAS-Kir2.1（CS-Gal4, UAS-Kir2.1）导致对较软侧的产卵偏好与对照组（仅CS-Gal4和仅UAS-Kir2.1）相比显著降低。为了排除偏好表型是由于运动缺陷损害了雌蝇选择能力的可能性，研究人员在不同Gal4品系中进行了侧重于基质化学成分而非刚度的产卵实验。结果表明，具有沉默机械感觉神经元的果蝇在表达对含糖基质的产卵偏好方面并未受损，这清楚地表明，沉默机械感觉神经元的果蝇并非因为运动缺陷而影响其表达刚度偏好的能力。这些数据共同证实了钟形感器和机械感器刚毛在调节不同刚度基质的产卵决策中的特定作用。

painless is necessary for the selection of softer oviposition patches in mechanosensory neurons innervating campaniform sensilla and mechanosensory bristles

为了直接测试Painless是否在CS和机械感器刚毛神经元中发挥作用以影响产卵基质选择，研究人员试图特异性调节pain在这些神经元中的表达。他们首先使用上述相同的Gal4品系驱动UAS-pain-IR构建体，在腿部的CS和机械感器刚毛中下调pain表达，并询问由此产生的RNAi是否会模拟在同一神经元中阻断神经传递时观察到的效应。在腿部化学感器刚毛中下调pain仅在与其中一个对照组相比时显示出产卵偏好的显著效应。然而，当使用CS2-Gal4、CS3-Gal4或R38B08-Gal4在腿部敲低pain时，观察到对较软基质的产卵偏好显著降低。这些结果表明，Painless蛋白直接参与腿部机械感觉神经元介导产卵地点选择的过程。用CS1敲低pain仅导致对较软基质偏好的轻微且不显著的降低，这可能是由于该品系靶向的感觉器官子集不同所致。为了加强这种联系，研究人员试图通过在这些机械感觉Gal4品系的控制下表达UAS-pain构建体，来挽救pain突变体观察到的刚度感知表型。果蝇表达三种Pain亚型中的两种，Painless^p60和Painless^p103，它们在机械感觉刺激下的反应截然不同。研究人员使用驱动剂R38B08-Gal4和CS1-Gal4，在两种不同的pain突变背景下测试雌蝇在腿部特定机械感觉神经元子集中表达这些亚型是否会增加其对较软基质的偏好。结果表明，在几种等位基因组合中，观察到对较软基质偏好的部分甚至接近完全的挽救，这表明pain的功能在腿部的机械感器刚毛和一些钟形感器中是介导对较软基质偏好所必需的。

综上所述，这项研究揭示了果蝇产卵时通过腿部TRP通道Painless感知基质刚度的新颖机制。研究表明，位于跗节的钟形感器和腹侧机械感器刚毛通过painless基因介导的机械感觉神经元通路，共同调控雌蝇对较软产卵基质的选择偏好。该研究不仅阐明了这些感觉器官作为刚度传感器的功能，还为理解昆虫机械感觉与行为决策的神经遗传基础提供了重要证据。研究结果还提示，painless基因功能或表达的变化可能介导了不同果蝇物种（如偏好成熟果实的D. suzukii和偏好腐烂果实的D. melanogaster）之间截然不同的产卵行为，为物种间行为差异的演化机制提供了新的视角。