《Horticultural Plant Journal》：In utero gene therapy: Pioneering diagnostic and therapeutic technologies
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先天性疾病的产前诊断与基因治疗进展综述，涵盖技术如荧光原位杂交、染色体微阵列分析，基因编辑技术CRISPR/Cas9的挑战与前景，纳米技术在靶向治疗中的应用，以及伦理问题。
作者：Shalmoli Seth、Malini Sen、Souvik Banerjee、Ritamay Sau、Somasree Ray
印度西孟加拉邦Durgapur的B.C. Roy药学与相关健康科学学院
摘要
产前成像、分子诊断和基因筛查技术的进步极大地改变了先天性疾病的处理方式，使得在子宫内就能实现早期识别和治疗。这些创新使得在临床症状出现之前就可以进行医疗干预，从而改善了治疗效果并减少了疾病的严重程度。通过对血液、组织和其他生物样本进行先进的基因检测，并结合荧光原位杂交和染色体微阵列分析等技术，可以精确地检测和分类单基因、线粒体、染色体和多因素疾病。新兴的子宫内疗法，特别是基因疗法，利用胎儿独特的发育特性，为结构和基因异常提供有针对性和最小侵入性的治疗。然而，仍存在一些关键挑战，例如确保生物相容性和实现高效的细胞内转基因传递。病毒和非病毒传递系统的进展以及基因编辑技术的进步为克服这些障碍带来了希望，为临床应用铺平了道路。纳米技术通过提供可定制的、稳定的平台，用于特定阶段和组织的目标干预，进一步增强了这些努力，扩大了成功的子宫内治疗范围。总体而言，这些产前诊断和治疗策略的进步为在疾病起源阶段解决先天性障碍提供了机会，显著改善了长期健康结果和生活质量。
引言
在全球范围内，先天性疾病的发病率正在急剧上升。每天出生的每2000名儿童中就有1名患有严重的先天性或遗传性疾病（Larson和Cohen，2006年）。根据世界卫生组织（WHO）的数据，由于疾病本身或其相关并发症，出生时存在解剖或功能异常的婴儿在四周大之前就会死亡（Osterman等人，无日期；Liu等人，2016年）。这些出生缺陷不仅会导致严重的发病率或死亡率，还会造成长期的后遗症，包括致残、不成比例的高医疗支出、心理压力，最重要的是生活质量下降（Apfeld等人，2019年）。
对于检测和治疗先天性疾病的关注与日俱增。研究人员一直在努力开发早期诊断某些先天性疾病的工具。目前，通常在孕早期通过常规的绒毛取样（CVS）获取胎儿组织进行诊断和基因分析（Kolaitis等人，2017年）。除了CVS之外，早期羊膜穿刺术、胎盘活检和胎儿血液取样也是获取胎儿细胞进行核型分析的各种侵入性超声引导采样方法（Surbeck和Holzgreve，2001年）。此外，对于单基因疾病或染色体异常的诊断，还使用PCR等分子生物学技术，这些技术需要胎儿血液（Rafi和Chitty，2009年）。因此，基因诊断技术的进步使得能够识别出许多先天性疾病的突变基因和致病突变因子，为子宫内治疗开辟了道路。
子宫内疗法，包括胎儿手术和干细胞移植，用于治疗特定的结构出生缺陷，而子宫内基因疗法则可以纠正表型异常，从而治疗母亲子宫内的多种遗传性疾病（Holzgreve，1997年）。与出生后疗法相比，子宫内疗法不仅在母亲和儿童的风险-收益平衡方面具有优势，而且由于其最小侵入性和广泛的治疗范围也具有潜在的好处。然而，将治疗基因有效且持久地传递到目标位置面临重大挑战（McClain & Flake，2016a）。因此，在本综述中，我们重点关注了各种子宫内诊断工具和子宫内基因治疗的传递技术，包括产前诊断方法、基因传递策略、新兴的基因组编辑方法、转化限制以及与遗传和产前干预相关的伦理考虑。
子宫内基因诊断和治疗利用了胎儿的独特发育特征，如体积小、对致畸物质的免疫能力、以及来自任何器官的干细胞的高增殖能力，以实现有效的长期目标基因修复（Peranteau和Flake，2020年）。
胎儿的小体积使得可以根据每个受体的体重比例进行有效的剂量调整。在妊娠期的第二孕期，当系统基因治疗技术上可行时，人类胎儿的体重仅为一岁儿童的1%。因此，小体积和较低的体重使得治疗更加高效且经济（Hartman等人，2018年）。
对于人类胎儿来说，某些身体部位和细胞更容易接触，例如胎儿的血脑屏障（BBB），在婴儿/新生儿中更具通透性，因此为不同的中枢神经系统细胞提供了易于攻击的目标。Ahad A Rahim等人在其研究中尝试评估单链和自互补的AAV2/9（腺相关病毒假型219）调节胎儿和新生儿神经系统并定向基因表达的能力。评估结果显示，基因表达在胎儿和新生儿的中枢和周围神经系统中都有发生。然而，胎儿中的表达强度高于新生儿，证明了BBB的更好通透性（Altaleb，无日期）。同样，在另一项研究中，CNMattar等人将AAV9传递给小鼠，并实现了神经细胞的阶段特异性转导。结果表明，胎儿中的神经元靶向效果优于新生儿。这证明了胎儿中特定身体部位更容易被接近（Mattar等人，2013年）。此外，丰富的前体细胞和细胞的频繁增殖特性提高了胎儿中基因编辑的可能性。
免疫系统是出生后基因治疗的主要障碍。然而，多项研究表明，由于胎儿缺乏成熟的免疫系统，在产前阶段进行基因沉默是成功的。例如，Charles Worth等人在其研究中旨在识别人类对Cas9蛋白的先天免疫反应。他们进行了酶联免疫吸附试验来检测抗Cas9抗体的存在。发现抗金黄色葡萄球菌 Cas9和化脓性链球菌 Cas9的抗体在人类血清中的比例分别为78%和58%。此外，使用抗原特异性T细胞得到的结果令人满意，从而证明了人类对Cas9的免疫反应（Charlesworth等人，2019年）。
子宫内基因治疗利用了胎儿的常规发育特征，如体积小、对致畸物质的免疫能力、以及来自任何器官的干细胞的高增殖能力，以实现有效的长期目标基因修复（Peranteau和Flake，2020年）。
胎儿的小体积使得可以根据每个受体的体重比例进行有效的剂量调整。在妊娠期的第二孕期，当系统基因治疗技术上可行时，人类胎儿的体重仅为一岁儿童的1%。因此，小体积和较低的体重使得治疗更加高效且经济（Hartman等人，2018年）。
对于人类胎儿，某些身体部位和细胞更容易接触，例如胎儿的血脑屏障（BBB），在婴儿/新生儿中更具通透性，因此为不同的中枢神经系统细胞提供了易于攻击的目标。Ahad A Rahim等人在其研究工作中尝试评估单链和自互补的AAV2/9（腺相关病毒假型219）调节胎儿和新生儿神经系统并定向基因表达的能力。评估结果显示，基因表达在胎儿和新生儿的中枢和周围神经系统中都有发生。然而，胎儿中的表达强度高于新生儿，证明了BBB的更好通透性（Altaleb，无日期）。同样，在另一项研究中，CNMattar等人将AAV9传递给小鼠，并实现了神经细胞的阶段特异性转导。结果表明，胎儿中的神经元靶向效果优于新生儿。因此证明了胎儿中特定身体部位更容易被接近（Mattar等人，2013年）。此外，丰富的前体细胞和细胞的频繁增殖特性提高了胎儿中基因编辑的可能性。
免疫系统是出生后基因治疗的主要障碍。然而，多项研究表明，由于胎儿缺乏成熟的免疫系统，在产前阶段进行基因沉默是成功的。例如，Charles Worth等人在其研究中旨在识别人类对Cas9蛋白的先天免疫反应。他们进行了酶联免疫吸附试验来检测抗Cas9抗体的存在。发现抗金黄色葡萄球菌 Cas9和化脓性链球菌 Cas9的抗体在人类血清中的比例分别为78%和58%。此外，使用抗原特异性T细胞得到的结果令人满意，从而证明了人类对Cas9的免疫反应的存在（Charlesworth等人，2019年）。
子宫内基因治疗面临独特的挑战，因为需要将基因转移载体安全有效地传递给胎儿而不伤害母亲[表1]。载体必须进入胎儿循环系统，同时不损害母亲的健康，这需要在向胎儿转移基因的同时尽量减少母亲的暴露。病毒载体的胎盘转运仍然不确定，需要在临床应用前进行进一步研究（Chan等人，2019年）。
一旦进入胎儿循环系统，载体必须靶向特定组织，这是一个复杂的任务，因为胚胎组织非常接近且敏感。当前的传递平台往往会导致广泛的转导，可能会无意中影响非目标组织（Mattar等人，2017年）。严格调控载体传递和使用组织特异性启动子对于避免致癌或生殖系修饰等有害后果至关重要。
载体被目标组织成功摄取取决于配体与细胞表面受体之间的相互作用，随后是内体处理（Rossidis等人，2018年）。动态的胎儿环境，包括波动的细胞膜分子、受体和组织因子，使这一过程变得复杂。胎儿的体温略高和pH值较低也可能影响基因转移效率。
为了达到治疗效果，载体基因组必须整合到胎儿细胞内，这具有挑战性，因为这些细胞的增殖特性极强。存在于宿主染色体外的表观遗传载体可能在细胞分裂过程中丢失，而整合到宿主基因组中的插入载体则存在插入突变的风险（Ricciardi等人，2018a）。尽管存在这些风险，表观遗传载体仍被优先用于子宫内基因编辑，以避免在切割位点的整合风险。
总体而言，优化传递载体以提高基因持久性和减少并发症对于推进子宫内基因治疗至关重要。
部分内容摘录
产前诊断（PND）
在子宫内识别异常情况有助于准确管理妊娠以及产前和产后的医疗干预。它还有助于就继续或终止妊娠做出明智的决定（Stembalska等人，2007年）。基因检测通常帮助医生识别胎儿以及可能将突变基因传给后代的患者和携带者的潜在遗传疾病。基因检测应用于
病毒传递
临床试验中的基因转移使用各种载体，根据组织趋向性、包装能力、免疫原性和生产效率进行分类（McClain & Flake，2016b；Basude和Overton，2012；Palanki等人，2021）。裸露的DNA可以直接注射到目标组织或器官中，但它容易受到内切酶的降解。由于体积大和带负电荷，子宫内的治疗性转基因无法直接穿过细胞膜
子宫内基因治疗的最新研究进展
子宫内基因治疗的最新研究进展在解决先天性疾病和预防终生健康并发症方面显示出巨大潜力。这种创新方法在胎儿发育早期针对遗传疾病，提供了在出生前纠正或缓解疾病进展的潜力。通过将治疗性基因传递给胎儿，研究人员旨在从根本原因上治疗多种疾病。
CRISPR/Cas9及其对子宫内基因治疗的影响
CRISPR（规律间隔短回文重复序列）/Cas9已成为当今最通用的基因组编辑平台。这种由细菌免疫系统起源的RNA引导的核酸酶复合体利用crRNA-tracrRNA导向信号靶向并切割外源DNA，从而在定义的基因组位点进行精确编辑。在Cas9内切酶切割DNA后，细胞激活内源性DNA修复途径来修复双链断裂（DSB）。
子宫内基因治疗的限制和挑战
尽管子宫内基因治疗在出生前纠正严重遗传疾病方面具有巨大潜力，但仍有许多科学、临床和伦理限制阻碍其实际应用。其中最主要的挑战是母亲和胎儿的安全性。与出生后干预不同，子宫内基因治疗涉及两个紧密相关的患者。任何传递给胎儿的载体、纳米颗粒或生物制剂都可能无意中进入母亲的循环系统
结论
近年来，先天性及遗传性疾病的发病率显著上升，每天大约每2000个活产婴儿中就有1人受到影响。这些疾病常常导致严重的发病率、早期死亡率、长期残疾、巨大的医疗费用和心理压力。因此，早期发现和治疗先天性疾病变得至关重要。产前诊断技术取得了显著进步，包括超声波、MRI等筛查方法
CRediT作者贡献声明
Shalmoli Seth：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，监督，概念化。Malini Sen：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿。Souvik Banerjee：撰写——初稿。Ritamay Sau：撰写——初稿。Somasree Ray：撰写——审稿与编辑，监督。
未引用的参考文献
Almeida-Porada等人，2016
Chappell等人，2024
Gonzaga等人，2008
Khandhar等人，2023
Lee等人，2005
Lisjak等人，2023
Maassel等人，2022
Mendia等人，2024
Meslin等人，2025
Mimoun等人，2023
Miyake等人，2024
Porada等人，2005
Swingle等人，2022
Themis等人，2005
Xue等人，2023
利益冲突声明
所有作者声明与本工作无关的利益冲突。
致谢
作者衷心感谢Gupta技术科学学院和B.C. Roy药学与相关健康科学学院的宝贵鼓励、深刻的反馈和在整个工作过程中的坚定支持。作者还向B.C. Roy药学与相关健康科学学院的副教授Abhik Si博士表示衷心的感谢，他的持续指导、专业建议和坚定的激励对此工作起到了重要作用
