AAV-PHP.eB外周递送在中枢神经系统的Cre依赖性转导效率与趋向性评估

《Journal of Comparative Neurology》：AAV-PHP.eB Peripheral Delivery and Central Expression in Cre Mice

本文系统评估了AAV-PHP.eB载体通过外周注射（如眶后静脉注射）在多种Cre工具鼠中实现脑内广谱神经元Cre依赖性转导的效率与特异性。研究发现，该载体虽能突破血脑屏障实现中枢递送，但在不同脑区及细胞类型间存在显著转导效率差异（如橄榄核转导效率低），并观察到低水平自发重组现象。研究为神经环路靶向工具的应用提供了重要实验依据，提示需根据特定细胞群体谨慎优化递送策略。

　　

1 引言

神经科学的核心挑战在于解析神经环路结构与功能如何共同调控行为。尽管立体定向注射腺相关病毒（AAV）载体可靶向特定脑区，但难以高效转导分布广泛的神经元群体。PHP.eB衣壳通过AAV9血清型的定向进化获得，能够在外周注射后穿越血脑屏障，实现中枢神经系统神经元转导。然而，该载体是否在不同脑区和神经元亚型中均一转导尚不明确。本研究通过眶后注射携带Cre依赖性报告基因的PHP.eB载体，系统评估其在多种Cre工具鼠中的转导效率、趋向性及特异性。

2 材料与方法

2.1 实验动物

研究选用C57BL/6J背景的Knockin-Cre及Cre报告小鼠（包括Foxp2-IRES-Cre、Hsd11b2-IRES-Cre、Lmx1b-2A-Cre、Nps-2A-Cre品系），所有动物均按爱荷华大学动物护理与使用委员会规范饲养。

2.2 病毒递送与组织处理

通过眶后静脉注射PHP.eB-FLEX-tdTomato病毒（剂量1.5×10¹¹vg/只），4周后灌注取脑，制备40 μm冠状冰冻切片。针对Foxp2-IRES-Cre小鼠橄榄核转导缺失现象，额外进行立体定向注射验证。

2.3 免疫组化与成像

采用DsRed、FoxP2、GFP、HSD2、Lmx1b、TH等抗体进行多重免疫荧光染色，通过奥林巴斯VS120显微镜获取全脑图像，并利用OlyVIA 4.2及Adobe Illustrator进行图像分析与排版。

3 结果

3.1 Nps-2A-Cre小鼠

在脑干核团（如疑核、臂旁核）及前脑（缰核、丘脑室旁核）中观察到tdTomato与内源性L10GFP的共表达，但大脑皮层及小脑中出现散在非特异性标记的神经元与星形胶质细胞。

3.2 Lmx1b-2A-Cre小鼠

tdTomato表达模式与Lmx1b分布基本一致，但在三叉神经核团、孤束核等区域转导效率存在差异。丘脑等本无Lmx1b表达的区域出现零星标记，提示非特异性转导。

3.3 Foxp2-IRES-Cre小鼠

小脑浦肯野细胞、皮层6层神经元及下丘脑等FoxP2阳性区域可见显著tdTomato表达，但 inferior olive（下橄榄核）几乎无标记。立体定向注射证实该区域可通过直接递送实现转导，提示外周注射的穿透限制。

3.4 Hsd11b2-IRES-Cre小鼠

孤束核HSD2神经元完全未被标记，仅出现与其它品系类似的皮层/小脑散在非特异性表达。

3.5 Cre阴性对照小鼠

三只对照鼠均出现大脑皮层及小脑浦肯野细胞的分散tdTomato表达，证实PHP.eB-FLEX载体存在低水平自发重组。

4 讨论

PHP.eB通过外周递送为广谱神经元靶向提供了新策略，但其转导效率受脑区、细胞类型及LY6A受体分布等因素影响。自发重组现象提示需优化Cre依赖性载体设计。未来研究应结合特定神经元群体的生物学特性，权衡广谱递送与精准靶向之间的平衡，以推动神经环路研究及基因治疗应用。