C19orf12突变通过溶酶体酸化异常调控自噬流：MPAN患者成纤维细胞蛋白质组学揭示新的生物标志物

《Neurobiology of Disease》：Autophagy-related proteomics reveals lysosomal alterations linked to C19orf12 mutations and candidate biomarkers in MPAN patients' fibroblasts

本研究针对线粒体膜蛋白相关神经退行性疾病(MPAN)中C19orf12突变与自噬异常关联机制不清的问题，通过蛋白质组学分析18例患者成纤维细胞，发现溶酶体pH调节相关蛋白表达显著改变，VPS28与疾病严重程度显著相关，且自噬流增强与突变合子性相关，为MPAN提供了新型生物标志物和病理机制新见解。

　　

在大脑深处一个被称为苍白球和黑质的区域，异常铁沉积正在悄悄侵蚀着神经细胞的功能——这就是伴有脑铁蓄积的神经退行性疾病(NBIA)的典型特征。作为NBIA中第三常见的遗传亚型，线粒体膜蛋白相关神经退行性疾病(MPAN)由C19orf12基因突变引起，但其导致铁异常蓄积和代谢紊乱的具体机制始终笼罩在迷雾中。尤其令人困惑的是，虽然先前研究提示自噬过程可能受损，但缺乏系统性的证据。自噬作为细胞"清洁工"，负责清除受损细胞器和错误折叠蛋白质，其功能障碍与多种神经退行性疾病密切相关。在MPAN患者大脑中观察到的α-突触核蛋白(α-synuclein)积聚现象，更暗示了自噬-溶酶体通路可能存在问题。

为了解决这些谜团，来自波兰尼基实验生物学研究所的研究团队开展了一项创新性研究，成果发表于《Neurobiology of Disease》。他们收集了18例MPAN患者的皮肤成纤维细胞，其中包括13例携带c.204_214del11纯合突变的患者和5例复合杂合突变患者，建立了目前最大的MPAN患者衍生细胞模型队列。通过对比6例健康对照，研究团队运用高通量蛋白质组学技术，聚焦239个自噬相关蛋白的表达谱，并结合功能实验深入探索了自噬流、溶酶体酸化和铁代谢等关键细胞过程。

研究采用的主要技术方法包括：基于液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的蛋白质组学分析，涵盖10,489个蛋白质的检测；使用LysoPrime Green和pHLyso Red荧光探针评估溶酶体质量和酸化程度；通过巴弗洛霉素A1(BafA1)处理结合Western blotting检测LC3II和p62蛋白水平来评估自噬流；应用FerroOrange探针检测细胞内亚铁离子(Fe²⁺)水平，并结合抗坏血酸处理区分总铁池。

2.1. MPAN成纤维细胞显示独特的自噬相关蛋白质组谱

研究人员从总共10,489个蛋白质中筛选出239个自噬相关蛋白，发现25个在MPAN患者中差异表达，其中21个上调，4个下调。特别值得注意的是，VPS28蛋白水平与疾病评分量表(DRS)的多个亚量表显著相关，即使在经过错误发现率(FDR)校正后仍保持统计学意义。此外，还有12个蛋白(ATP6AP2、ATP6V0C等)与至少三个DRS亚量表显著相关，展现出作为疾病进展生物标志物的潜力。

2.2. MPAN患者自噬相关蛋白质组的差异受C19orf12突变合子性影响，并在自噬通路溶酶体相关阶段达到峰值

研究团队按自噬阶段系统分析了蛋白质表达变化。在自噬启动阶段，AMPK(AMP激活蛋白激酶)亚基、mTORC1(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1)和ULK1(unc-51样自噬激活激酶1)复合体组分均显示表达改变，主成分分析(PCA)显示这些变化与突变合子性密切相关。在自噬体形成阶段，参与PI3P(磷脂酰肌醇3-磷酸)产生、自噬体扩张和膜闭合的蛋白质也呈现显著改变。特别引人注目的是，与溶酶体相关的阶段——包括自噬体-溶酶体融合和货物降解——显示出最明显的差异。通过新开发的判别评分(DS)系统比较各阶段，发现溶酶体pH调节相关蛋白的DS值高达4.10，远高于其他自噬阶段，表明这是MPAN中最显著受影响的自噬相关过程。

2.3. MPAN患者成纤维细胞显示溶酶体pH调节蛋白上调和溶酶体腔酸化增加

对溶酶体pH调节机制的深入分析发现，空泡型H⁺-ATP酶(V-ATP酶)亚基在MPAN患者中普遍上调，尤其是在杂合突变患者中最为明显。功能实验证实，这种上调伴随着溶酶体腔的过度酸化，而溶酶体质量本身并无显著变化。巴弗洛霉素A1处理实验证明这种酸化确实由V-ATP酶活性驱动。

2.4. MPAN患者成纤维细胞中的自噬流似乎增强且具有更大容量，取决于C19orf12突变的合子性

通过BafA1阻断实验评估自噬流，发现MPAN细胞中LC3II的积累程度显著高于对照，表明自噬流增强。同时，BafA1处理的MPAN细胞比对照细胞显示出更高的LC3II基础水平，提示自噬容量增加。这些变化在携带复合杂合突变的患者中更为明显。

2.5. 携带C19orf12杂合突变的MPAN患者成纤维细胞显示细胞内亚铁水平升高

考虑到溶酶体在铁代谢中的核心作用，研究人员检测了铁稳态参数。发现MPAN患者细胞内Fe²⁺水平显著升高，同时铁储存蛋白铁蛋白重链1(FTH1)和轻链(FTL)也相应上调，尤其是在杂合突变患者中最为明显，表明细胞正在通过上调铁蛋白来应对增加的亚铁负荷。

研究结论和讨论部分强调了这些发现的重要意义。该研究首次在大型MPAN患者队列中系统描绘了自噬相关蛋白质组谱，鉴定出VPS28等有前景的生物标志物候选物。最重要的是，研究发现溶酶体酸化增强是MPAN中最一致受影响的自噬相关过程，而非先前假设的自噬抑制。这种过度酸化可能是细胞对潜在代谢压力的适应性反应，但长期维持这种状态需要消耗大量能量，可能导致神经元代谢储备耗竭。溶酶体功能改变也部分解释了MPAN中铁代谢紊乱的机制：过度酸化的环境可能促进Fe³⁺向Fe²⁺的转化，导致亚铁积累，进而通过芬顿反应加剧氧化应激。研究还揭示了突变合子性对表型严重程度的重要影响，复合杂合突变患者通常表现出更显著的细胞异常。

这些发现不仅深化了对MPAN病理机制的理解，也为未来治疗策略提供了重要启示：针对自噬的干预需要谨慎考虑，因为进一步激活已经增强的自噬流可能适得其反。相反，调节溶酶体pH稳态或铁代谢可能成为更有前景的治疗方向。该研究建立的成纤维细胞模型也为未来药物筛选和个性化医疗提供了实用平台。